揭示早期分化真菌米根霉中普遍存在的DNA腺嘌呤甲基化调控网络

《Nature Communications》：Unveiling a pervasive DNA adenine methylation regulatory network in the early-diverging fungus Rhizopus microsporus

本研究针对早期分化真菌中转录因子(TF)结合位点研究匮乏的现状，利用DAP-seq技术系统解析了米根霉(Rhizopus microsporus)中58个受6mA甲基化调控的转录因子的全基因组结合特征。研究成功鉴定了这些TF的结合基序和靶基因，揭示了6mA甲基化通过调控TF间接影响基因表达的广泛网络，并深入阐释了锌代谢和光响应等关键生物学过程的调控机制。该工作不仅深化了对米根霉基因调控机制的理解，更为真菌界的基因调控进化研究提供了重要见解。

　　

在生命科学的广阔图景中，真菌王国以其惊人的多样性占据着独特地位，从酿造面包的酵母到生产青霉素的青霉，从引起作物病害的病原菌到生产昂贵松露的子囊菌，真菌与人类生活息息相关。然而，在这庞大的真菌家族中，有一类被称为"早期分化真菌(EDF)"的成员却长期被科学家们忽视。这些真菌在进化树上位于基础位置，代表着真菌界最早的分支，它们拥有独特的生物学特性，但由于遗传操作困难和研究工具有限，其基因调控机制一直是个未解之谜。

其中，米根霉(Rhizopus microsporus)作为一种早期分化真菌，特别引人关注。它不仅是重要的农业病原菌，能够与内生细菌共生而具备植物致病能力，还是发酵食品生产的关键菌种，更令人担忧的是，它是引起毛霉病的常见病原体，这种感染被世界卫生组织列为高度优先关注的致命疾病。更独特的是，米根霉与其他早期分化真菌、纤毛虫和绿藻一样，使用N⁶-甲基腺嘌呤(6mA)作为其主要DNA表观遗传修饰，这种修饰与基因表达密切相关，并且对该真菌的生存至关重要。

尽管科学家们已经认识到6mA在米根霉中的重要性，但这一表观遗传标记如何通过调控转录因子(TF)来间接影响基因表达，仍是一个悬而未解的问题。传统研究转录因子结合位点(TFBS)的技术如染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)在非模式生物中应用受限，而新兴的DNA亲和纯化测序(DAP-seq)技术为这一难题提供了突破性解决方案。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Carlos Lax、Leo A. Baumgart等研究人员开展了一项系统性工作，旨在揭示米根霉中由6mA介导的转录调控网络。他们应用DAP-seq技术，成功绘制了58个受6mA调控的转录因子的全基因组结合图谱，这些因子代表了主要的转录因子家族。通过整合DNA 6mA甲基化谱数据，研究团队揭示了这种表观遗传修饰对基因表达的广泛直接影响，并利用生成的数据识别了参与锌代谢和光响应等生物学过程的转录因子。

研究采用的主要技术方法包括：DAP-seq技术用于全基因组范围内鉴定58个转录因子的结合位点；Western blot分析验证蛋白质表达；RT-qPCR分析基因表达；CRISPR-Cas9基因编辑技术构建基因敲除突变体；生物信息学分析包括 motif 分析、基因本体(GO)富集分析、系统发育分析和启动子结构比较分析。所有实验均使用米根霉ATCC 11559菌株，在标准实验室条件下进行培养和处理。

真菌转录因子景观

研究人员首先对62种真菌物种（其中43种为早期分化真菌）的基因组进行了扫描，重点关注51个转录因子家族。分析发现，转录因子家族在真菌界表现出显著的多样性，早期分化真菌与双核菌门(Dikarya)之间以及各早期分化真菌门内部都存在明显差异。

特别值得注意的是，某些转录因子家族如E2F和Tubby在双核菌门中缺失，而RFX和STAT等家族虽然在双核菌门中存在，但在早期分化真菌中却完全缺失或数量急剧减少。此外，不同早期分化真菌门系之间也存在显著差异，如球囊菌门(Glomeromycota)中HMG-box家族的扩张，以及毛霉门(Mucoromycota)具有最高的转录因子景观多样性。

利用DAP-seq表征米根霉cistrome

研究团队通过DAP-seq技术成功鉴定了58个转录因子的结合特征，这些因子属于11个不同的家族，包括广泛分布的bZip、GATA锌指、HLH、同源框和热激因子(HSF)家族。

5%的转录因子。左右面板分别对应第一次和第二次重复实验。b 每个家族中通过过滤的转录因子比例。灰色表示FRIP<5%。c 基于motif相似性的转录因子motif聚类，使用R包motifStack。外圈表示转录因子家族。d 将米根霉DAP-seq motif与JASPAR motif数据库比较。将每个米根霉转录因子motif的最佳匹配与所有新鉴定的motif进行比较。颜色代码代表每个motif比较的得分(-log10 P值)。e bZip、HLH、HSF、GATA和同源框家族在蛋白质编码基因上的peak频率分布。TSS向上游和下游各延伸1kb，并分成25个相等大小的区间。f 米根霉基因组特征中peak的比例。考虑了与(e)中相同的转录因子家族。源数据作为源数据文件提供。'>

实验结果显示，HLH、同源框、GATA和HSF家族的表现尤为出色，成功率分别为89%、92%、82%和87%，而CBF、Tubby和PHD型锌指的所有转录因子均未能产生可靠数据。研究共识别出50,597个peak，每个转录因子的peak数量从20到数千个不等。通过聚类分析发现，所有HLH、GATA、同源框、HSF和bZip的motif都与同一家族的转录因子聚集在一起，表明这些家族内具有高度保守的靶序列。

不同转录因子家族显示靶基因和功能多样化

研究人员进一步分析了每个转录因子的潜在靶基因，发现58个分析的转录因子在靶基因数量上表现出很大差异，从CP2-TF1的仅6个到GATA Znf6、HOX2或HLH Myc1的数百个不等。

0.05，Fisher精确检验，双尾）。彩色矩形将靶向具有相似功能基因的转录因子簇分组。颜色对应于(a)和图2c中使用的每个转录因子家族的颜色。源数据作为源数据文件提供。'>

基因网络分析揭示了由特定转录因子家族调控的明显分化的基因群。功能富集分析显示，HLH转录因子的靶基因显示出与脂质代谢、氧化还原稳态和GTP代谢等多种生物功能相关的明确聚类模式。GATA转录因子靶基因也显示出清晰的功能富集模式，调控参与氨基酸生物合成以及其他重要过程（如碳水化合物运输和硫酸盐同化）的基因。

DNA 6mA在调控网络中起核心作用

6mA是米根霉中的基本表观遗传修饰，与转录活跃基因相关。研究发现，58个转录因子共同靶向4272个基因，占米根霉基因组的40%，这表明6mA通过调控转录因子间接控制了基因组的相当大部分。

分析发现，2222个基因既受转录因子潜在调控又受6mA甲基化影响，占所有转录因子调控基因的三分之一以上，接近所有甲基化基因的60%。综合考虑直接和间接靶标，6mA直接或间接控制了米根霉近四分之三的基因，这解释了为什么在这种真菌中失去6mA是致命的。

特别值得注意的是，不同转录因子和家族间靶基因的甲基化状态存在显著差异，HLH型转录因子显示出对甲基化基因最强的结合偏好。当主要甲基转移酶Mta1的表达降低时，五个研究的转录因子（Znf1、HLH2、HLH Myc5、GATA Znf3和GATA Znf10）失去了甲基化，其中四个表达下调，它们20%至33%的靶基因也出现差异表达。

DAP-seq数据揭示白领蛋白对光调控基因的控制

研究的转录因子集合中包含一个白领-2(WC-2)型蛋白，称为GATA Znf10，这使得研究团队能够探索由白领光受体调控的蓝光响应基因。

研究发现WC-2C与1394个潜在靶基因有强结合信号，特别富集在启动子区域。其结合基序被鉴定为GATC，与真菌中白领蛋白描述的共识结合序列一致。在光调控的2871个基因中，427个基因（14.8%）在其启动子区域显示WC-2C结合peak，其中大多数（344个基因）被诱导，而83个基因被抑制，表明WC-2C在这种真菌中主要作为转录激活因子发挥作用。

通过构建wc-2c基因敲除突变体，研究人员验证了WC-2C在调控这些基因中的作用，发现六个光响应基因在突变体中无法响应光而上调。wc-2c突变体在光照下孢子产生增加，气生菌丝发育减少，孢子囊梗在菌丝体基部积累增加，这与光诱导crgA基因（WC-2C靶标之一）功能丧失的表型一致。

研究结论与意义

这项研究通过DAP-seq技术系统性地揭示了早期分化真菌米根霉中由6mA甲基化介导的转录调控网络，代表了在理解真菌进化早期分支调控机制方面的重要进展。研究不仅提供了多样化真菌转录因子的结合位点信息，还深入揭示了其相关调控网络。

特别值得关注的是，研究发现6mA通过调控转录因子间接控制了基因组的很大部分，强调了这种表观遗传修饰在转录调控网络中的关键作用。不同转录因子家族对甲基化基因的差异亲和力揭示了复杂的调控层次，而针对锌代谢和光响应等生物学过程的个案研究则展示了DAP-seq数据在解析特定生理过程调控机制方面的强大能力。

尽管研究存在一定局限性，如缺乏使用ChIP-seq等替代方法进行靶标验证，但重复的DAP-seq实验为转录因子结合位点提供了可靠信息。对自调控环路和启动子结构保守性的分析揭示了真菌界调控机制的进化规律，突出了所生成数据的广泛相关性。

这项工作不仅增进了对米根霉生物学的理解，更丰富了我们对真菌界基因调控机制的认识，为未来研究早期分化真菌及其他真菌的基因调控进化奠定了坚实基础。研究所产生的数据集将成为真菌遗传学研究社区的宝贵资源，促进对真菌生物学基础方面的更深入探索。