Lgr5三潜能干细胞驱动舌后部味觉与唾液腺谱系生成的机制研究

《Nature Communications》：Tripotent Lgr5 stem cells in the posterior tongue generate lingual, taste, and salivary gland lineages

本研究为解决舌后部味蕾、唾液腺及舌面上皮的发育关系不明问题，通过单细胞RNA测序、谱系追踪及类器官培养等技术，揭示了Lgr5阳性干细胞具有生成非味觉舌上皮、味蕾细胞和冯·埃布纳腺的三向分化潜能，并发现转录因子Foxe1在此过程中的关键调控作用，为理解味觉功能障碍与唾液分泌异常的共病机制提供了新视角。

　　

在口腔感官世界中，味觉扮演着至关重要的角色。然而，头颈部癌症患者放疗后常出现口干症（xerostomia），其中高达80%的患者会伴随味觉障碍（dysgeusia）或味觉丧失（ageusia）。自身免疫性疾病如干燥综合征（Sjogren's syndrome）也会导致慢性口干和味觉功能异常。这些症状不仅影响营养摄入，还会降低生活质量。舌后部的轮廓乳头（circumvallate papillae, CVP）和叶状乳头（foliate papillae, FoP）中含有味蕾，其附近有专门的唾液腺——冯·埃布纳腺（von Ebner glands, VEG），这些腺体分泌的唾液对于维持味觉敏感性至关重要。尽管味蕾与唾液腺在解剖位置上紧密相邻，但它们在出生后及成年阶段的发育关系尚不明确。

此前的研究已知，Lgr5（leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5）标记了多种组织中的干细胞，包括肠道、胃、毛囊和肝脏。在小鼠味蕾中，Lgr5也被证实标记了味蕾干细胞。然而，是否存在一种共同的干细胞能够同时生成味蕾、唾液腺以及非味觉舌上皮，仍是一个悬而未决的问题。为了解决这一科学难题，来自荷兰公主马克西玛儿科肿瘤中心、荷兰癌症研究所和胡布雷赫特研究所的研究团队，在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员综合运用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、多色谱系追踪（multicolor lineage tracing）和类器官（organoid）培养等关键技术。他们从20只成年雌性小鼠中解剖了20个轮廓乳头和40个叶状乳头进行单细胞测序，构建了舌后部的细胞图谱。利用Lgr5-EGFP-IRES-creERT2/R26-Confetti转基因小鼠进行体内谱系追踪，并建立了源自单个Lgr5+干细胞的克隆类器官模型，以验证其多向分化潜能。此外，还通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了Foxe1基因敲除类器官，以研究该转录因子在细胞命运决定中的作用。

单细胞图谱揭示舌后部细胞多样性

通过对小鼠CVP和FoP进行单细胞RNA测序，研究人员获得了20,320个高质量细胞图谱。分析后鉴定出10个主要的细胞簇，包括非周期性的基底祖细胞（Krt5+, Krt14+）、周期性的基底祖细胞（表达Mki67）、非味觉舌上皮细胞（non-taste LEC）、Lgr5+干细胞以及I、II、III、IV型味蕾细胞。

值得注意的是，数据集还包含了唾液腺特征的细胞，如导管细胞（表达Dcpp1）、肌上皮细胞（表达Acta2）和腺泡细胞（表达Muc19），表明该图谱全面涵盖了舌后部上皮及其附属结构的细胞多样性。

味蕾与唾液腺细胞的精细分型

对味蕾区细胞的进一步分析清晰展示了I型（Entpd2+）、II型（Gnat3+, Trpm5+）、III型（Car4+, Snap25+）和IV型（Lgr5+, Shh+, Sox2^high）味蕾细胞。在II型细胞中，还区分出了负责苦味（表达T2rs和Gnat3）和甜/鲜味（表达T1rs和Gna14）的亚群。

唾液腺区分析显示，VEG包含混合的浆液性（表达Bhla15, Amy1）和黏液性（表达Aqp5, Muc19）腺泡细胞，以及导管细胞和肌上皮细胞。CVP的VEG同时含有浆液性和黏液性细胞，而FoP的VEG则主要为黏液性细胞，分别类似于下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG）的表型。

Lgr5与Sox9共表达提示干细胞多能性

研究发现，一部分Lgr5+干细胞同时表达Sox9（唾液腺发育的关键因子），而另一部分则与Sox2（味蕾祖细胞标志）共表达。组织学染色在CVP的味蕾区与唾液腺区交界处的沟槽（trench）区域观察到了Lgr5驱动的GFP表达，并且存在Lgr5/Sox2和Lgr5/Sox9双阳性细胞，这提示可能存在一种能够同时向味蕾和唾液腺分化的双潜能或三潜能干细胞。

对已发表的味蕾类器官scRNA-seq数据的再分析发现，这些类器官中不仅存在味蕾细胞，还表达了导管标志物（如Dmbt1, Cldn2）和腺泡标志物（如Aqp5），进一步支持了类器官中同时存在味蕾和唾液腺细胞。

三潜能Lgr5干细胞的体外验证

为了在克隆水平上验证Lgr5干细胞的多向分化潜能，研究人员从Lgr5-EGFP小鼠的CVP类器官中分选出单个Lgr5-GFP阳性细胞进行克隆性扩增。

对其中三个克隆（克隆1、3、7）进行单细胞测序，结果显示这些克隆来源的类器官中包含基底祖细胞、Lgr5+干细胞样细胞、肌上皮样细胞、非味觉舌上皮细胞以及同时表达唾液腺（如Sox9, Cldn10, Aqp5）和味蕾（如Sox2, Entpd2）标志物的混合细胞群体。将类器官数据集与原始组织数据集整合后，证实了克隆类器官中确实存在非味觉舌上皮、味蕾和唾液腺三种谱系的细胞。

体内谱系追踪证实三向分化

为了在体内验证单个Lgr5+干细胞的三向分化能力，研究人员使用了Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2/R26-Confetti小鼠进行多色谱系追踪。他莫昔芬诱导后，在2个月的追踪样本中，观察到了由单个Lgr5+干细胞衍生出的克隆，其细胞后代同时存在于味蕾、非味觉舌上皮和VEG导管中。

量化分析显示，大多数克隆贡献给味蕾，这与味蕾细胞快速更新（10-14天）而唾液腺细胞更新较慢（>60天）的特性一致。有趣的是，源自沟槽区域的少数克隆能够贡献给多个相邻的味蕾以及唾液腺，提示Lgr5+干细胞池内可能存在等级结构，部分干细胞具有更广泛的再生潜能。

Foxe1调控细胞命运决定

通过伪时间分析（pseudotime analysis）基因表达动态，研究人员发现转录因子Foxe1在Lgr5干细胞中高表达，并在向味蕾和唾液腺分化过程中表达下降。

功能实验表明，在CVP和FoP来源的类器官中敲除Foxe1后，分化标志物Krt8+细胞的比例显著下降，而干性标志物（Sox9, Lgr5, Krt14）表达升高。RNA-seq分析进一步证实，Foxe1缺失导致唾液腺相关基因表达减少，味蕾细胞类型比例发生变化，I型和III型味蕾细胞特征减弱，而更倾向于II型细胞表型。这表明Foxe1在调控Lgr5干细胞向唾液腺分化以及维持味蕾细胞亚型平衡中起着关键作用。

结论与意义

本研究通过多维度的实验证据，有力地证明了舌后部CVP和FoP中存在一种三潜能的Lgr5+干细胞，它能够生成非味觉舌上皮、味蕾细胞和冯·埃布纳唾液腺细胞。这一发现将味蕾及其相关的唾液腺定义为一个源自共同干细胞的“化学感觉单元”（chemosensory unit）。研究不仅揭示了舌后部组织发育和稳态维持的新的细胞谱系原理，而且发现了Foxe1在这一过程中的重要调控功能。

该研究具有重要的科学意义和潜在的临床价值。首先，它深化了我们对口腔复杂组织结构发育来源的理解。其次，为理解味觉功能障碍（如放疗或干燥综合征引起的口干和味觉丧失）的病理机制提供了新的视角——这些症状可能不仅源于唾液分泌减少或味蕾祖细胞直接受损，也可能与这个共同干细胞库的功能紊乱有关。此外，建立的三潜能干细胞类器官模型为研究舌后部疾病的病理生理、药物筛选和潜在的再生医学策略提供了强大的体外研究平台。未来，通过优化培养条件定向诱导特定谱系分化，或将为相关疾病的治疗带来新的希望。