MAX2泛素连接酶-受体-底物复合物协同感知独脚金内酯的分子机制

《Nature Communications》：Mechanism of cooperative strigolactone perception by the MAX2 ubiquitin ligase–receptor–substrate complex

本研究通过冷冻电镜解析了由拟南芥ASK1、独脚金ShMAX2 F-box蛋白、ShHTL7受体和AtSMAX1底物组成的独脚金内酯信号传导复合物结构，揭示了激素水解后D环共价结合受体、底物通过双结构域动态互作稳定复合物并重定位ASK1以实现高效泛素化的分子机制，为理解植物激素信号转导提供了新框架。

　　

在植物王国中，独脚金内酯（strigolactones, SLs）扮演着双重角色：既是调控植物分枝和根系发育的重要激素，又是引发寄生植物萌发的信号分子。尤其是一种名为独脚金（Striga hermonthica）的寄生植物，能够感知宿主作物根系分泌的独脚金内酯，进而萌发并侵染作物，导致非洲地区每年数十亿美元的粮食损失。尽管科学家们早已知道独脚金内酯通过SCF^MAX2 E3泛素连接酶复合物触发转录抑制子的降解来传递信号，但激素结合如何精确转化为底物泛素化的分子机制始终是未解之谜。

传统观点认为，独脚金内酯直接结合F-box蛋白MAX2，但后续研究发现实际情况更为复杂：独脚金内酯实际上结合的是α/β水解酶家族受体D14/HTL，引发激素水解后，受体才能与MAX2相互作用，进而招募SMXL家族转录抑制子并引导其泛素化降解。然而，这一过程中的关键环节——完整的受体-连接酶-底物复合物的结构和动态变化——一直未被揭示，主要原因是该复合物存在时间短暂、相互作用动态多变，难以用传统结构生物学方法捕捉。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员巧妙利用物种特异性特点，成功捕获了由拟南芥SKP1（ASK1）、独脚金ShMAX2 F-box蛋白、ShHTL7受体和AtSMAX1底物组成的活性信号复合物，并通过冷冻电镜解析了其高分辨率结构。研究发现，独脚金内酯被HTL7水解是其信号传导的前提条件，水解后产生的D环共价结合在受体催化组氨酸H246上，触发受体构象变化，使其能够与MAX2结合。更重要的是，底物SMAX1通过其N端和D2结构域与复合物形成动态接口，不仅稳定了受体-连接酶组装体，还引起了ASK1的空间重排，为后续泛素化过程创造了有利条件。

研究的关键技术方法包括：利用昆虫细胞和大肠杆菌系统表达纯化各复合物组分；通过尺寸排阻色谱和pull-down实验验证复合物稳定性；采用单颗粒冷冻电镜技术解析复合物三维结构；运用氢-氘交换质谱分析复合物动态特性；结合AlphaFold结构预测进行模型构建和验证。实验使用的Striga hermonthica HTL7受体和ShMAX2蛋白与拟南芥同源蛋白形成异源复合物，冷冻样品在添加GR24（一种合成独脚金内酯类似物）后2-3小时内制备以确保捕获活性信号状态。

结构景观与复合物组装

研究人员成功解析了三种不同组成的复合物结构：未结合配体的ASK1-MAX2复合物（2.7?分辨率）、2:2 ASK1-MAX2二聚体（3.3?分辨率）以及ASK1-MAX2-HTL7复合物（2.7?分辨率）。

其中最完整的是ASK1-MAX2-HTL7-SMAX1四元复合物，呈现出独特的海马形状拓扑结构：HTL7构成头部，MAX2的LRR结构域形成身体，而MAX2的N端F-box motif与ASK1共同组成尾部。

进一步的3D分类揭示了SMAX1底物与复合物相互作用的动态特性。第一类颗粒（6万，2.8?分辨率）显示SMAX1的N结构域结合在MAX2的LRR结构域靠近ASK1的位置；第二类颗粒（8万，2.9?分辨率）则主要显示SMAX1的D2结构域结合在HTL7和MAX2之间；而第三类颗粒（1.7万，3.3?分辨率）首次同时解析了N和D2两个结构域的密度，尽管分辨率较低。这种结构异质性表明SMAX1通过多价、动态的方式与复合物相互作用，不同结构域可能独立结合，共同稳定信号传导复合物。

闭合D环是信号传导状态的关键

在复合物结构中，HTL7受体的lid结构域呈现闭合构象，与之前报道的开放状态明显不同。

更重要的是，研究人员在催化组氨酸H246附近发现了明显的额外密度，与共价结合的闭合D环结构吻合，而非之前某些研究中提出的开放形式CLIM。质谱分析进一步证实，GR24处理后的HTL7确实在H246上存在C₅H₅O₂修饰，而对照组则无此修饰。

D环被HTL7的疏水残基（Y26、M139、Y174、L178和I193）紧密包裹，这些残基远离催化中心，在受体开放构象时形成238?³的空腔，而在MAX2结合的闭合构象中 collapse至18?³，没有空间容纳未切割独脚金内酯的ABC环。同时，催化三联体中的H246和D217之间的距离从开放状态的2.7?增加至3.6?以上，破坏了催化活性，使共价结合的D环在HTL7内部稳定存在。这些结构特征表明，独脚金内酯的水解和D环的共价捕获是HTL7与MAX2完成对接的前提条件。

底物稳定MAX2-HTL7相互作用

SMAX1的D2结构域对其泛素化和降解至关重要，但其结构基础一直不明确。研究发现，SMAX1D2与典型AAA+ATP酶的核苷酸结合结构域存在显著差异：其Walker A motif呈螺旋构象，遮蔽了核苷酸结合位点；GYGV motif被RGKT motif替代，该 motif在SMAX1同源物中高度保守。在复合物中，D2通过带电荷和极性接触与MAX2的LRR表面互作（埋藏面积928?²），同时通过疏水界面与HTL7相互作用（埋藏面积430?²）。特别是RGKT motif中的R700像楔子一样插入MAX2的LRR17和LRR18环之间，与D643和D645形成离子键，与T609形成氢键，稳定了HTL7与MAX2的关联。

功能实验表明，删除RGKT motif（ΔRGKT）或引入点突变（R700E/L731D/R744E）都会削弱复合物稳定性，而保守替换为AGAA则影响较小，证明该motif在复合物组装中起关键作用。这些发现说明SMAX1D2是一个被重新利用的ATP酶结构域，其功能从催化转变为结合模块，确保MAX2-HTL-底物复合物的正确组装和定位。

N结构域相互作用的特性

SMAX1的N结构域属于Clp重复（ClpR）家族，由两个四螺旋束重复组成，具有伪二重对称性。冷冻电镜数据显示，第二个重复（而非第一个）通过其C端螺旋（H4'，残基S153-N166）与MAX2的LRR1和LRR2疏水斑块相互作用。该界面还通过SMAX1N的R145和R148与ASK1的E146、E147和E150之间的氢键和电荷相互作用进一步稳定。与apo ASK1-MAX2结构相比，SMAX1结合导致MAX2的LRR4的helix-β环向外位移达6.9?，表明底物结合诱导了显著的构象变化。

含有N和D2结构域的SMAX1ND2构建体能够与MAX2和HTL7稳定结合，而单独的D2结构域稳定作用较弱，证明N结构域虽然结合力较弱，但其与D2结构域的共价连接对于复合物稳健稳定至关重要。这种双齿相互作用可能通过增加局部浓度和避免过度亲和力增益，在保持动态性的同时提高整体结合亲和力和特异性。

复合物动态特性的生化证据

氢-氘交换质谱（HDX-MS）分析为复合物的动态特性提供了生化证据。GR24处理显著增加了HTL7的HDX，特别是在lid结构域和支撑催化残基D217和H246的环状结构中，表明独脚金内酯暴露本身就增加了HTL7的柔韧性。当MAX2和SMAX1存在时，HTL7的HDX部分逆转，尤其是lid结构域中在开放和闭合构象间变化的螺旋区域稳定性增加，证实D2结构域在MAX2上稳定了GR24结合的HTL7。

相比之下，SMAX1（全长或D2）在复合物形成过程中未显示显著HDX变化，与其瞬时、动态的相互作用模式一致。ASK1在所有测试复合物中均未检测到HDX变化，与结构数据相符。这些结果共同支持了SMAX1D2在MAX2上稳定GR24结合HTL7的模型。

特异性决定因素

尽管D2结构域与受体的接口相对较小（约430?²），但同源建模表明， cognate对（SMAX1-HTL7和SMXL7-D14）之间的互补性优于非cognate组合，表明D2-受体兼容性可能贡献底物特异性。然而，这种特异性并非绝对：SMXL6和SMXL7（均为D14特异性底物）在pull-down实验中也能与GST-HTL7共沉淀，而OsD3-HTL7和AtMAX2-HTL7同源复合物即使在没有SMAX1同源物的情况下也能在SEC中稳定结合。

研究还发现，SMAX1 N结构域的辅助相互作用有助于稳定D2介导的与MAX2和HTL7的关联。SMAX1与独脚金SMXL同源物（ShSMXL1、ShSMXL2和ShSMXL3）的N结构域高度保守（71-91%同一性），远高于与拟南芥SMXL6（47%）或水稻D53（45%）的同一性。这些保守区域包括SMAX1N用于与MAX2结合的螺旋H3'和H4'，表明MAX2关联在进化上保守。研究人员提出，特异性不仅由受体-底物匹配决定，更源于多个协调接触提供的累积稳定性和动态 interplay。

SMAX1动态稳定SCF^MAX2用于泛素化

冷冻电镜数据揭示了ASK1相对于MAX2的铰链式运动。在仅显示ASK1和MAX2密度的类别中，ASK1的延伸helix-turn-helix元件的尖端接触MAX2的LRR11和LRR12（"静止状态"），而其C端螺旋元件（CTH）不可见，表明完全脱离LRR结构域。相反，在有SMAX1和HTL7的复合物中，ASK1被向后拉动，失去与LRR的接触（"回缩状态"），同时CTH变得可见并处于"接合"状态。

3D变异性分析表明，ASK1回缩和CTH接合与SMAX1N密度存在相关，表明SMAX1有助于稳定这种构象。在基于SMAX1N密度最大的Class 1的冷冻电镜模型中，SMAX1N的精氨酸残基与ASK1的谷氨酸形成离子相互作用。与apo ASK1-MAX2结构相比，LRR1和LRR2螺旋向HTL7移动1.5-2?，进一步支持了SMAX1N促进MAX2 CTH与ASK1 C端螺旋在接合/回缩状态下形成接触。

研究人员通过模板建模构建了完整的E2-SCF^MAX2-受体-底物复合物模型，发现SMAX1的D2a亚结构域最靠近泛素结合的E2，提示泛素化优先发生在此区域。几个赖氨酸（K597、K610、K643和K650）聚集在面向E2连接酶的D2a区域，是潜在的泛素化位点。ASK1在静止和回缩状态之间的铰链运动通过CUL1杠杆臂被放大，使SMAX1 D2结构域相对于E2位移达7?。回缩状态将D2结构域置于远离泛素加载E2的位置，这可能不利于泛素化效率，但SMAX1 N结构域的瞬时结合及相关构象变化可能导致敲击运动和位置变异，这可能为多聚泛素化所必需。

ASK1-MAX2二聚体

尽管SEC未观察到二聚化，冷冻电镜数据集揭示了二聚体ASK1-MAX2类别，占总颗粒的三分之一。天然PAGE显示微弱的二聚体条带，质谱光散射显示体外存在单体和二聚体的混合群体。二聚化源于MAX2的LRR1和LRR2上的疏水N结构域结合斑块之间的C2对称关联，以及LRR1的R86与ASK1 C端螺旋的E146、E147和E150之间的电荷补偿。二聚体界面与N结构域结合位点重叠，提示二聚化与SMAX1结合存在竞争，可能减少体外SMAX1含有的ASK1-MAX2（-HTL7）颗粒数量。

研究结论与意义

本研究通过解析首个SCF^MAX2-受体-底物复合物结构，揭示了独脚金内酯信号传导的分子机制。研究发现独脚金内酯水解是信号传导的前提，水解产生的D环共价结合受体催化组氨酸，触发受体构象变化，使其能够与MAX2结合。底物SMAX1通过其N和D2结构域与复合物形成动态接口，不仅稳定了受体-连接酶组装，还引起了ASK1的空间重排，为高效泛素化创造条件。

这一机制阐明了如何将激素感知转化为靶向蛋白降解，提供了植物如何整合激素信号进入发育决策的见解。特别重要的是，研究揭示了复合物内部的精细动态调控：弱个体关联的波动导致E2与底物之间的敲击运动，可能正是多聚泛素化所需的机制。这种动态性确保了信号传导的精确调控，避免过度反应。

对于独脚金防治而言，该研究阐明了独脚金如何利用宿主衍生信号启动萌发的分子基础，为开发特异性抑制独脚金萌发的策略提供了新靶点。由于独脚金与宿主植物的SL感知机制高度保守，实现选择性靶向一直是个挑战，而对复合物界面和动态性的深入理解可能启发新的干预策略。

更重要的是，这项工作展示了E3连接酶在植物激素感知中的精细调控机制，强调了动态相互作用在信号转导中的核心作用。这种机制可能普遍存在于其他激素信号通路中，为理解植物如何整合多种信号应对复杂环境提供了新范式。