拓扑异构酶IIβ结合位点揭示癌症基因组局部突变过程与驱动突变

《Nature Communications》：Topoisomerase IIb binding delineates localized mutational processes and driver mutations in cancer genomes

本研究针对TOP2B在癌症突变过程中的作用机制这一关键科学问题，通过绘制人类癌症样本中TOP2B、CTCF和RAD21的DNA结合图谱，并分析6500个全癌基因组数据，发现TOP2B-CTCF-RAD21和TOP2B-RAD21结合位点显著富集体细胞突变和结构变异。研究证实TOP2B结合位点是癌症驱动基因如TP53、MYC等的突变热点，并在体内实验中验证了非编码RNA基因RMRP启动子区域的突变驱动肿瘤发生，为理解TOP2B介导的基因组不稳定性提供了新视角。

　　

在基因组的三维空间中，DNA不断经历着拓扑应力带来的挑战。转录、复制等细胞过程会导致DNA产生缠结和打结，若不能及时解决将引发基因组不稳定甚至细胞死亡。这一关键任务由II型拓扑异构酶承担，它们通过催化可逆的DNA双链断裂来缓解拓扑应力。其中，TOP2B（拓扑异构酶IIβ）因其在非分裂细胞中的独特活性而备受关注，特别是在化疗药物引发的基因毒性方面。然而，这种维持基因组完整性的必需酶，却可能成为一把"双刃剑"——其介导的DNA断裂在特定情况下会转化为突变来源，这一矛盾现象背后的机制尚不明确。

长期以来，科学家们注意到拓扑异构酶靶向药物如多柔比星在治疗血液肿瘤和实体瘤的同时，也会引发治疗相关白血病，其中MLL（KMT2A）易位与TOP2B活性密切相关。尽管有证据表明TOP2B在转录过程中会产生DNA损伤和易位，但它在癌症突变过程中的全面作用仍有待探索。癌症基因组中既存在少数驱动突变，也包含大量由各种突变过程产生的乘客突变。这些过程在多个层面影响基因组，从核苷酸水平的突变特征到局部突变富集，再到与染色质可及性相关的大规模突变负荷变异。然而，许多突变过程的机制和病因仍不清楚。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Liis Uuskula-Reimand等人通过整合TOP2B在人类癌症样本中的全基因组DNA结合图谱与6500个癌症全基因组数据，系统揭示了TOP2B结合与局部突变过程之间的深刻联系。研究发现TOP2B结合位点不仅是体细胞突变的热点区域，更是结构变异频发的"重灾区"，特别是在进化上保守、转录活跃且具有长程染色质相互作用的调控元件处。

研究人员首先利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术，在人类肝细胞肝癌（HCC）样本中绘制了TOP2B、CTCF和RAD21的DNA结合图谱。通过严格的质控和分析，他们鉴定出83,749个结合位点，其中51%为TOP2B结合位点，包括16,258个TOP2B-CTCF-RAD21共同结合位点和20,731个TOP2B-RAD21结合位点。这些位点显示出高度的进化保守性和表观遗传活性，70%的TOP2B-CTCF-RAD21位点存在于至少90%的ENCODE人类细胞系中，且与组成性活跃的CTCF结合位点高度重叠。

进一步分析显示，TOP2B结合位点富含活跃转录起始位点和启动子区域，与高基因表达水平和频繁的启动子-增强子染色质相互作用密切相关。特别是在TOP2B-RAD21位点，研究人员观察到突变富集与转录活性和染色质相互作用频率呈正相关，表明TOP2B介导的突变过程具有显著的上下文依赖性。

在突变过程分析中，团队采用RM2方法系统比较了结合位点与侧翼序列的突变负荷。结果显示，TOP2B-CTCF-RAD21和TOP2B-RAD21位点在多数癌症类型中均显著富集小突变，尤其在肝癌、乳腺癌、肺癌、食管癌和前列腺癌中最为明显。突变模式分析揭示了不同的局部突变特征：TOP2B-CTCF-RAD21位点表现为峰值summit处的焦点突变富集，而TOP2B-RAD21位点则呈现更平滑广泛的突变负荷增加。

结构变异分析更揭示了令人瞩目的发现：TOP2B结合位点在全癌样本中显著富集结构变异断点（SVBP）。TOP2B-CTCF-RAD21和TOP2B-RAD21位点的SVBP频率显著高于缺乏TOP2B结合的对照位点。特别值得注意的是，结合位点中点与最近SVBP的距离在TOP2B结合位点中显著更近，暗示TOP2B活性直接参与这些基因组重排的形成。

通过ActiveDriverWGS方法，研究团队在TOP2B结合位点中鉴定出249个频繁突变调控元件（FMRE），其中189个涉及TOP2B结合，显著高于预期。这些FMRE富集于41个已知癌症驱动基因，包括TP53、MYC、PTEN和EGFR等主要癌基因。尤为重要的是，研究发现了163个富含非编码突变的FMRE，为癌症非编码驱动突变研究提供了宝贵资源。

在具体案例中，研究揭示了TOP2B结合与经典癌症驱动突变之间的空间关联。例如，IDH1基因的R132氨基酸替代热点位于TOP2B结合的FMRE内；VHL肿瘤抑制基因中的TOP2B-RAD21结合FMRE富集移码插入缺失和无义突变，与转录抑制相关；EGFR癌基因中的TOP2B-RAD21结合FMRE包含T790M耐药突变热点，与基因表达上调相关。

结构变异热点分析更是揭示了TOP2B在癌症基因组重排中的核心作用。TP53启动子区的TOP2B-CTCF-RAD21结合位点是显著的结构变异热点，在61个癌症样本中富集缺失和易位。在前列腺癌转移样本中，该位点的结构变异与TP53表达抑制显著相关。类似的，MYC启动子区的TOP2B-CTCF-RAD21结合FMRE在B细胞非霍奇金淋巴瘤中富集易位，与免疫球蛋白重链基因座易位，导致MYC显著上调。

为验证这些发现的生物学意义，研究人员选择RMRP非编码RNA基因启动子区的一个TOP2B-CTCF-RAD21结合FMRE进行功能验证。该位点在40个转移性乳腺癌样本中显著富集小突变。通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术，研究人员在人类乳腺上皮细胞MCF10A和小鼠皮肤癌模型中对该FMRE进行编辑。令人瞩目的是，在表达致敏性Pik3ca^H1047R癌基因的小鼠模型中，FMRE突变导致肿瘤发生显著早于对照组。体外实验中，FMRE突变细胞在三维生长实验中表现出增强的增殖表型。

转录组分析进一步揭示了FMRE突变细胞的分子特征：641个基因在二维和三维培养条件下呈现一致的表达改变，这些基因显著富集于细胞迁移、伤口愈合调控、细胞粘附和发育过程等癌症相关通路。虽然RMRP、CCDC107和ARHGEF39等位点基因本身未发生表达改变，但NOTCH1、FAT1、ERBB3等癌症相关基因均出现差异表达，表明该非编码驱动突变通过复杂的表观遗传和调控网络影响肿瘤发生。

本研究的技术方法主要包括：从临床肝癌样本中通过ChIP-seq技术绘制TOP2B、CTCF和RAD21的全基因组DNA结合图谱；整合PCAWG和HMF项目的6495个癌症样本的全基因组测序数据，涵盖18种主要癌症类型；使用RM2和ActiveDriverWGS等计算方法分析局部突变过程和驱动突变；通过CRISPR/Cas9基因组编辑和小鼠模型进行功能性验证。

研究结果部分，图1展示了人类癌细胞中TOP2B的全基因组结合景观，揭示了TOP2B结合位点的保守性和功能特征。图2分析了癌症基因组中TOP2B结合位点的小突变过程，显示这些位点在多种癌症类型中显著富集突变。图3证明结构变异断点在TOP2B结合位点富集，特别是在高转录活性和频繁染色质相互作用的位点。图4鉴定了TOP2B结合位点的频繁突变调控元件，包括已知癌症基因和非编码候选驱动突变。图5详细描述了TOP2B结合位点在已知癌症驱动突变中的作用，如TP53、IDH1等基因的突变热点。图6通过实验验证了RMRP/CCDC107位点的FMRE作为非编码癌症驱动因子，证明其突变可促进肿瘤发生和发展。

研究的讨论部分强调，TOP2B在维持基因组完整性方面的关键作用与其作为体细胞突变源的潜在风险之间存在微妙平衡。虽然TOP2B介导的DNA双链断裂对染色质结构和转录调控至关重要，但这些断裂也可能转化为突变事件，特别是在拓扑异构酶靶向化疗药物存在的情况下。本研究通过系统整合多组学数据，将TOP2B结合与局部突变过程和癌症驱动突变联系起来，为理解癌症基因组的进化提供了新视角。

这些发现对癌症基因组学研究和临床实践具有重要意义。一方面，TOP2B结合位点可作为癌症突变过程的生物标志物，有助于识别潜在的驱动突变和易感区域。另一方面，对TOP2B介导突变机制的深入理解，可能为优化拓扑异构酶靶向化疗策略提供参考，平衡治疗效果与基因毒性风险。此外，研究中鉴定的大量非编码FMRE为探索癌症非编码驱动突变提供了丰富资源，有望推动癌症生物学研究范式的转变。

该研究也存在一定局限性，如TOP2B结合与体细胞突变之间的关联主要基于多组学数据整合，因果证据尚有限；TOP2B结合图谱来自肝细胞肝癌，可能无法完全代表其他组织类型中的情况；数据分析受样本异质性和统计效能限制等。未来研究需要通过TOP2B功能调控实验和整合临床数据，进一步阐明TOP2B在癌症突变过程中的具体机制和临床意义。

总之，这项研究确立了TOP2B作为癌症基因组中突变过程和热点的重要标志物，揭示了其在基因组完整性维护和突变生成中的双重角色，为癌症基因组学研究和精准医疗发展提供了重要理论基础。