独脚金内酯代谢酶CXE15的催化与氧化还原调控分子机制解析

《Nature Communications》：Molecular Basis for Catalysis and Regulation of the Strigolactone Catabolic Enzyme CXE15

本研究解析了拟南芥羧酸酯酶CXE15降解独脚金内酯(SLs)的分子机制。通过晶体结构分析发现CXE15通过N端延伸区介导二聚化形成联合活性中心，其活性受氧化应激诱导的二硫键调控。该工作揭示了植物通过ROS信号通路调控SL稳态的新机制，为作物抗逆育种提供新靶点。

　　

在植物王国中，独脚金内酯（strigolactones, SLs）扮演着多重关键角色。这种神奇的植物激素不仅调控植物的分枝结构、根系发育等生理过程，还作为"化学信使"被根系分泌到土壤中，用于招募丛枝菌根真菌建立互利共生关系，帮助植物获取水分和磷等营养元素。然而，这种信号分子也被寄生植物独脚金所"劫持"，成为其种子萌发的信号，导致农作物严重减产。正是这种双重身份，使得SLs的稳态调控成为植物学研究的焦点。

长期以来，科学家们已知SLs的受体DWARF14（D14）本身具有水解SLs的能力，但其水解速度过慢，无法有效调控SLs水平。直到最近，拟南芥中的羧酸酯酶CXE15被鉴定为真正的SLs降解酶，但其分子机制和调控方式仍不明确。随着全球气候变化加剧，非生物胁迫对作物生产的威胁日益严重，揭示植物如何通过精密调控SLs水平来应对环境胁迫，成为当前植物生物学领域的重要科学问题。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，由沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学（KAUST）的Umar F. Shahul Hameed和Aparna Balakrishna等科学家领导的研究团队，通过多学科交叉的方法，揭开了CXE15催化SLs的分子奥秘及其精巧的环境调控机制。

研究人员主要运用了蛋白质晶体学、生物化学分析、分子动力学模拟和植物体内实验等关键技术方法。其中通过X射线晶体学解析了CXE15的四种不同构象状态，利用生物物理技术（微量热泳动、SEC-MALS、SAXS）研究蛋白质相互作用，并结合分子对接、点突变分析和转基因拟南芥模型验证功能。植物实验材料为野生型拟南芥（Col-0）及其转基因株系。

CXE15结晶显示单体与二聚体形式具有不同的N端构象

研究人员成功解析了拟南芥CXE15的四个晶体结构，发现其N端延伸区（Nt）在单体和二聚体中呈现截然不同的构象。在单体结构中，Nt形成β-折叠结构，而在二聚体中则转变为相互缠绕的螺旋结构。这种构象变化与CXE15的寡聚状态密切相关，其中P3₂21空间群中的结构为单体形式，而P4₁2₁2空间群中的结构则形成了稳定的二聚体。

特别值得注意的是，在二聚体结构中，两个单体通过Cys14残基之间形成二硫键而稳定结合。为验证这一发现，研究人员构建了C14S点突变体，并发现其虽然仍能形成二聚体，但N端螺旋缩短，稳定性降低。

CXE15结构揭示与已发表模型的关键差异

与同期发表的其他CXE15结构相比，本研究发现了重要差异。重新分析已发表的衍射数据表明，之前的模型未能识别N端区域的trans构象和二聚体架构，同时也忽略了Cys14间的二硫键。这些差异解释了为何先前研究未能发现二硫键稳定的CXE15二聚体形式。

二聚化产生容纳SL催化所需的联合活性位点

结构分析显示，CXE15的催化三联体为Ser169/Glu271/His302，与D14及其同源蛋白KAI2和HTL的空间位置相对应，这解释了为何CXE15能执行与D14相同的SL切割反应。然而，两者的配体结合位点配置存在显著差异。

分子对接实验表明，单体CXE15的活性位点过于浅表，无法容纳GR24（SL类似物），而二聚体则在两个活性位点之间形成了一个疏水空腔，完美契合GR24分子。重要的是，每个二聚体只能容纳一个GR24分子，且GR24进入活性位点需要N端螺旋的打开，这一过程被二聚体间的二硫键所阻碍。

CXE15二聚化和催化活性依赖于N端残基

微量热泳动（MST）实验证实，在还原条件下CXE15能以微摩尔级的亲和力自关联形成二聚体（K_d = 1.62 ± 0.39 μM）。C14S突变体仍能二聚化，但亲和力略有下降。破坏性点突变实验（如F89R、W94R、三联突变体L17R/L18R/L21R等）均损害了CXE15的二聚化能力。酵母双杂交实验进一步验证了这些发现，表明N端螺旋中的疏水残基对稳定CXE15二聚体至关重要。

二聚体形式在氧化条件下共价稳定

尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）分析显示，在还原条件下CXE15以单体形式存在，而经过H₂2O₂处理后则主要形成二聚体。非还原SDS-PAGE分析证实纯化的CXE15在10 mM H₂2O₂处理后形成共价连接的二聚体，而C14S突变体在氧化条件下仍保持单体状态。小角X射线散射（SAXS）数据进一步支持了晶体学单体和二聚体在体外的存在。

二硫键交联的CXE15二聚体抑制催化

YLG（Yoshimulactone Green）水解实验和LC-MS分析均表明，纯化的H₂2O₂处理的CXE15二聚体没有催化活性，而在还原条件（10 mM DTT）下催化活性得以恢复。C14S突变体在氧化处理后仍保持催化活性，而缺失N端40个氨基酸的截短变体（CXE15Δ40）完全丧失催化功能，证实了N端在二聚化和活性位点形成中的关键作用。

氧化还原滴定实验确定了C14二硫键的 midpoint potential（E_m）为-332 ± 4 mV（pH 7.0），这一相对较低的氧化还原电位表明C14二硫键在典型细胞质条件下主要保持还原状态，仅在更强氧化环境中才会被氧化。

CXE15在植物体内形成二聚体

利用分裂YFP的双分子荧光互补（BiFC）技术在本氏烟草叶片中瞬时表达CXE15，观察到强烈的YFP-CXE15信号，表明CXE15在植物细胞中形成二聚体。C14S或C14D突变使BiFC荧光减弱超过两倍，与这些突变体降低的自关联亲和力一致。

ROS阻断拟南芥中的SL降解

为验证二硫键对CXE15活性的调控作用，研究人员构建了CXE15过表达拟南芥株系。与野生型（Col-0）相比，CXE15过表达株系和SL缺陷型max3突变体均表现出典型的高分枝和矮化表型。甲基紫精（诱导ROS产生）处理不影响max3植株的分枝表型，但显著减少了CXE15_OE8的分枝数。

SL含量检测显示，Col-0拟南芥中的甲基卡尔内酯酸（MeCLA）含量显著高于CXE15_OE8植株，而甲基紫精处理后两者MeCLA含量相当，表明CXE15在植物体内被ROS失活。在高盐和磷酸盐饥饿胁迫条件下，CXE15过表达株系增强的分枝表型同样被抑制，证实CXE15在氧化应激下被抑制。

本研究揭示了CXE15调控SL稳态的双重机制：一方面，通过蛋白表达水平或局部富集程度调节二聚化状态来控制酶活性；另一方面，通过ROS诱导的Cys14氧化形成二硫键，直接抑制SL降解活性。这一机制确保了在磷酸盐饥饿等胁迫条件下，植物能维持较高的SL水平，从而促进丛枝菌根真菌共生和结构适应性调整。

该研究不仅阐明了α/β水解酶核心通过结构延伸适应特定功能的进化策略，还为理解植物应激响应中的分子通路提供了新见解。这些发现对农业粮食生产具有重要意义，因为SL稳态在调控作物分枝和抗逆性中发挥着关键作用。通过揭示ROS如何通过靶向抑制SL降解来调节激素代谢，本研究扩展了对植物氧化还原调控的结构理解，为作物抗逆育种提供了新的分子靶点。