CMG解旋酶不对称手递手易位及核小体穿越机制的计算模拟研究

《Nature Communications》：Mechanistic models of asymmetric hand-over-hand translocation and nucleosome navigation by CMG helicase

本研究针对真核生物CMG解旋酶如何实现单向易位、解旋双链DNA并穿越核小体屏障的机制难题，通过粗粒度分子动力学模拟结合ATP驱动的构象切换，揭示了四种不同ssDNA结合状态间不对称旋转转变介导的“不对称手递手”易位机制，并阐明了RPA与FPC（Csm3/Tof1）分别通过清除滞后链堵塞和锚定亲本双链来增强解旋进程性，同时发现FACT可降低核小体穿越能垒并抑制组蛋白错误转移至滞后链，为理解真核复制体协同工作机制提供了新视角。

　　

在真核细胞中，DNA复制是生命信息准确传递的基础过程。这一过程的核心引擎是CMG（Cdc45-Mcm2-7-GINS）解旋酶，它负责在复制叉前端解开双链DNA（dsDNA），为DNA聚合酶提供单链DNA（ssDNA）模板。CMG需要沿着前导链模板以3’→5’方向进行单向易位，同时将滞后链模板排除在其中心通道之外。然而，这个异源六聚体AAA+ ATP酶如何协调其六个Mcm亚基的ATP水解活性来实现高效、定向的易位和DNA解旋，其物理化学机制尚不完全清楚。尤其具有挑战性的是，在染色质环境中，CMG必须穿越紧密包裹DNA的核小体障碍，同时确保组蛋白及其修饰信息的准确遗传。理解CMG如何与复制体相关因子（如RPA、FPC复合物）和组蛋白分子伴侣（如FACT）协同工作，以应对这些挑战，是现代分子生物学的一个核心问题。

本研究发表在《Nature Communications》上，研究人员利用计算模拟方法，深入探究了CMG解旋酶的工作机制。为了开展研究，作者主要应用了以下几个关键技术方法：基于冷冻电镜结构的粗粒度分子动力学模拟，其中蛋白质采用AICG2+模型，DNA采用3SPN.2C模型；ATP水解驱动的构象切换模拟方案，通过周期性切换能量函数来模拟CMG不同DNA结合状态间的转变；以及包含20个蛋白质组分的复制体超大复合物建模，包括CMG、FPC（Mrc1/Csm3/Tof1）、Ctf4、RPA、FACT和核小体。

机理探索CMG沿ssDNA的易位

为了探究CMG沿ssDNA的易位机制，研究人员基于酿酒酵母CMG复合物的冷冻电镜结构，构建了粗粒度模型。他们选择了三种代表性的构象（状态1-3），并引入了基于黑腹果蝇CMG结构同源建模的第四种状态（状态4）。

通过实施构象切换方案模拟ATP水解驱动的变化，模拟表明，在状态1→2→3→1的三状态循环中，70%的轨迹实现了3’→5’方向的易位，净位移为12±1个核苷酸，但30%的轨迹因状态3→1转变时的亚基锚定错误（Mcm3而非Mcm6保持结合）导致倒退或空转。这表明可用的冷冻电镜结构可能未捕获到所有必需的构象中间体。

引入状态4后，采用状态1→2→3→4→1的四状态循环进行模拟，所有20条轨迹均实现了高效的3’→5’方向易位，净位移为11±3 nt。状态3→4和状态4→1的转变确保了Mcm6作为锚定亚基，从而偏向于生产性易位。这一四状态不对称手递手模型与生化证据（即并非所有Mcm2-7 ATP酶亚基对易位都必需）相符，支持了其物理化学可行性。

机理探索CMG对dsDNA的解旋

接下来，研究人员构建了Y形叉DNA底物，以研究CMG驱动的dsDNA解旋。

模拟发现，CMG的易位效率受上游碱基对稳定性的影响。在随机DNA序列下，40%的轨迹显示向前易位4-8 nt，40%空转，20%倒退。使用poly-AT序列时，60%的轨迹发生易位，而使用更稳定的poly-GC序列时，仅10%的轨迹成功。此外，滞后链ssDNA重新退火并堵塞CMG中心孔道的现象在poly-GC序列中更为频繁，这表明较强的碱基配对稳定性会阻碍CMG易位。

RPA与叉保护复合体（FPC）的作用机制

研究表明，RPA和FPC通过不同机制增强CMG的解旋活性。

RPA结合滞后链ssDNA，通过防止滞后链堵塞CMG中心孔来促进解旋，在poly-AT和poly-GC序列上均能显著提高向前易位的轨迹比例（90%）和平均位移。FPC（特别是Csm3/Tof1）则直接锚定在亲本双链DNA上，通过静电相互作用抑制CMG的回溯（backtracking）。在poly-GC序列上，FPC和Ctf4能大幅减少倒退轨迹的比例（从65%降至35%），而当RPA、FPC和Ctf4共存时，倒退轨迹进一步降至15%，表明它们在稳定解旋方面具有协同效应。

机理探索酿酒酵母CMG穿越核小体的易位

在染色质复制过程中，CMG必须穿越核小体。模拟中，CMG-FPC复合物被放置在核小体入口DNA的不同位置。

当CMG前沿位于SHL(-7)（叉连接点距核小体22 bp）时，60%的轨迹可实现≥4 bp的易位，Csm3/Tof1促进了入口DNA的部分解缠绕至SHL(-4.5)。然而，当CMG更深入地进入核小体，起始位置为SHL(-5)、SHL(-4)或SHL(-3)时，易位效率显著下降，平均位移从SHL(-7)的4±4 nt降至SHL(-3)的0±1 nt，表明在靠近核小体对称轴（dyad）的SHL(-4.5)附近存在一个显著的能垒。

研究还发现，当CMG进展超过SHL(-4)时，部分解缠绕会暴露H2A/H2B二聚体表面，使得滞后链DNA能够直接与之结合，这提示了亲本组蛋白可能直接回收至滞后链的途径。

FACT促进CMG易位并调控组蛋白回收

组蛋白分子伴侣FACT被引入系统以研究其作用。

模拟表明，FACT的Spt16 C末端固有无序区域（IDR）能迅速结合由解缠绕暴露的H2A/H2B表面，阻止DNA重新与该区域结合。FACT的存在促进了更深入的核小体解缠绕（例如，从SHL(-5)起始时，45%的轨迹出现超越SHL(-3)的解缠绕），从而帮助CMG穿越染色质屏障。更重要的是，FACT显著减少了滞后链与暴露的组蛋白表面结合的概率（例如，从SHL(-3)起始时，结合轨迹从20%降至10%），表明FACT通过占据H2A/H2B界面，抑制了组蛋白直接转移至滞后链的途径。

讨论与结论

本研究通过粗粒度分子动力学模拟，为CMG解旋酶的不对称手递手易位机制提供了物理化学上的合理性证明。研究确定了四个不同的构象状态，其顺序转变能够驱动沿ssDNA的单向3’→5’运动。该机制与生化观察结果一致，即并非所有Mcm亚基都需要ATP酶活性。研究进一步揭示了辅助因子RPA和Csm3/Tof1通过截然不同的机制增强CMG功能：RPA通过清除滞后链堵塞来促进易位，而Csm3/Tof1通过锚定亲本双链来抑制回溯。在染色质背景下，核小体构成了CMG前进的主要障碍，尤其是在核小体对称轴附近的SHL(-4.5)位置存在显著能垒。组蛋白分子伴侣FACT能够通过促进核小体DNA解缠绕来降低此能垒，同时其Spt16的C末端尾部通过占据暴露的H2A/H2B二聚体表面，有效抑制了滞后链DNA与组蛋白的直接结合，从而防止了不适当的组蛋白直接回收。

这些发现为理解真核DNA复制过程中解旋酶易位、核小体导航、组蛋白分子伴侣功能以及组蛋白回收是如何被协调起来的提供了一个可检验的机制框架。该研究提出了关于CMG易位机制的明确预测，例如其异质性的步进模式，这可以通过高分辨率光学镊子等单分子技术进行验证。同时，关于FACT在辅助CMG穿越核小体中的作用机制，也可通过体外重构实验进行进一步验证。尽管模型的粗粒度性质存在局限，但本研究的结果为深入探索染色质复制的复杂协调机制奠定了坚实的基础。