蓝细菌肽途径中激酶结构域的发现与工程化实现酪氨酸磷酸化修饰

《Nature Communications》：Phosphorylation of peptides by a kinase domain in cyanobactin pathways

本研究针对天然产物生物合成中罕见的磷酸化修饰，报道了在蓝细菌肽（cyanobactin）生物合成基因簇中发现的嵌入式激酶结构域。研究人员通过异源表达、结构域删除和定点突变等技术，证实该激酶可特异性催化线性及环状底物中Tyr残基的磷酸化，并成功将该结构域移植至sphaerocyclamide途径获得磷酸化新产物。该发现拓展了核糖体肽的翻译后修饰多样性，为磷酸化肽类的组合生物合成提供了新工具。

　　

在天然产物药物研发领域，磷酸化修饰犹如一把"分子雕刻刀"，能显著改善小分子的药理特性。然而在核糖体合成后修饰肽（RiPPs）家族中，这种修饰却极为罕见。蓝细菌肽作为结构多样、活性显著的天然肽类家族，其生物合成途径已被发现可进行异环化、氧化、异戊烯化等多种修饰，但磷酸化修饰的机制始终成谜。近期《Nature Communications》发表的研究，终于揭开了这一谜底。

研究人员通过对藻华藻株Dolichospermum sp. LEGE 00240和Aphanizomenon sp. PH219的基因组挖掘，发现了两个特殊的蓝细菌肽生物合成基因簇（BGCs）。这些基因簇的独特之处在于其编码的G蛋白酶/大环化酶中嵌入了一个激酶结构域（PF00069.24）。生物信息学预测显示，该结构域可能负责催化核心肽的磷酸化修饰。为了验证这一猜想，研究团队采用直接途径克隆（DiPaC）技术，将11.2 kb的dol BGC完整克隆至大肠杆菌表达系统，成功检测到dolichospermamide A（1）及其单磷酸化（2）、双磷酸化（3）产物，质谱分析证实磷酸化位点位于Tyr39和Tyr42残基。

通过位点定向突变实验，研究人员系统阐明了激酶的底物偏好性。将DolE2核心肽中的Tyr39和Tyr42分别突变为Phe后，磷酸化产物显著减少；而双突变体（Y39F+Y42F）则完全丧失了磷酸化能力。值得注意的是，当仅保留Ser39或Thr39时，激酶仍能催化磷酸化，表明该酶具有较宽松的底物特异性。最关键的是，将催化关键残基Asp574突变为Ala或直接删除激酶结构域后，磷酸化产物完全消失，而非磷酸化环肽1的产量不受影响，充分证明了激酶结构域的特异性功能。

为了验证激酶结构域的工程化潜力，研究团队将其移植至sphaerocyclamide生物合成途径的SphG蛋白中。令人振奋的是，工程化菌株成功产生了同时携带异戊烯化和磷酸化修饰的新化合物20（[M+H]⁺ m/z 998.4388），质谱分析显示磷酸化发生于Ser残基，而异戊烯化修饰位于Tyr残基。这一突破性结果表明，激酶结构域能够与异戊烯转移酶协同工作，实现多重修饰的精准引入。

体外酶活实验进一步证实了激酶结构域的独立功能。研究人员纯化了包含激酶结构域及其侧翼序列的His-Kinase[401-742]蛋白，发现其能够有效磷酸化线性和环状肽底物。对于环状DolE2衍生肽，可检测到单磷酸化和双磷酸化产物；而对于线性肽，仅观察到单磷酸化形式。这种差异提示环状构象可能更利于激酶的催化效率。

生物信息学分析显示，类似的激酶编码G蛋白酶同源物广泛存在于Microcystis、Moorena等9个属的蓝细菌中，其中部分基因簇还编码异环化酶和氧化酶结构域，表明G蛋白酶可整合多达4个催化结构域。这种模块化架构为理性设计多重修饰的蓝细菌肽提供了无限可能。

本研究采用的关键技术包括：基于直接途径克隆（DiPaC）的异源表达平台、位点定向突变技术、结构域删除与移植策略、体外酶活测定以及AlphaFold2蛋白质结构预测。研究所用藻株来源于葡萄牙LEGE-CC和芬兰UHCC菌种保藏中心。

研究结果部分显示，通过异源表达验证了dol BGC负责dolichospermamides的生物合成，质谱解析确认了磷酸化位点；突变实验证明激酶对Tyr残基具有偏好性但底物特异性宽松；结构域移植成功实现sphaerocyclamide途径的磷酸化工程化；体外实验证实激酶对环状底物具有更高催化效率。

结论与讨论部分强调，该研究首次在蓝细菌肽途径中发现功能性激酶结构域，拓展了RiPPs家族的化学多样性。激酶结构域的模块化特性使其成为组合生物合成的有力工具，为理性设计磷酸化修饰的 therapeutic peptides（治疗性肽）开辟了新途径。与已知磷酸化RiPPs（如microcin C、paeninodin）相比，该激酶属于PKc-like超家族，且作用于成熟环肽而非前体肽，体现了独特的催化机制。这项研究不仅深化了对天然产物生物合成逻辑的理解，更为药物先导化合物的结构优化提供了新策略。