电活性微生物光激发胞外电子触发RAFT聚合：合成生物学助力活性材料可控构建

《Nature Communications》：Photo-excited extracellular electron transfer of electroactive microorganism triggers RAFT polymerization

本研究针对微生物触发可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合中存在的末端基团异质性和链终止问题，开发了基于希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）光激发胞外电子转移（EET）的新型聚合体系。研究人员通过合成生物学手段强化黄素类物质（flavins）的生物合成与转运，利用微生物代谢产生的电子经黄素介导的光诱导电子转移（PET）直接还原链转移剂（CTA）持续产生自由基，实现了对多种单体和CTA的高效可控聚合（转化率>90%，分散度D<1.20），为活性材料构建提供了可持续平台。

　　

在合成生物学与材料科学的交叉前沿，如何让活的微生物细胞直接触发可控聚合反应，是构建具有生命特性的功能材料（Engineered Living Materials）的关键挑战。传统的可逆失活自由基聚合（RDRP）技术，如原子转移自由基聚合（ATRP）和可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合，虽然能精确控制聚合物分子量、分布和拓扑结构，但在活细胞参与的反应体系中，外源性自由基引发剂的使用往往导致聚合物末端基团异质性（end-group heterogeneity）和链终止问题，同时引发剂的高浓度还会对细胞活性产生毒性，限制了活性材料的发展。

以往的研究表明，微生物可以通过其代谢活性激活外源性引发剂（如芳基重氮盐）来产生自由基，进而引发RAFT聚合，但这种方法无法避免由引发剂衍生的新链不断生成和目标链终止的积累，使得聚合物分子量控制困难，分散度（dispersity, D）增加，尤其在合成嵌段共聚物时更为明显。为了消除引发剂对聚合物质量的影响，光或电等外部刺激被用来触发电子转移，直接还原链转移剂（chain transfer agent, CTA）产生自由基。然而，在生理条件下，微生物分泌的电子穿梭体（如黄素类物质）的还原电位通常高于CTA（即硫代羰基硫化合物），从热力学上难以直接还原CTA，这成为开发微生物触发原位RAFT聚合的主要障碍。

hq）。光激发FL_hq形成光激发中间体FL_hq*，通过PET还原CTA产生自由基，引发RAFT聚合。'>

针对这一挑战，来自东北大学、天津大学等机构的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项创新性研究，他们成功构建了一种电活性微生物触发的RAFT聚合系统。该系统利用模型外产电菌——希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）分泌的黄素类物质（包括核黄素和黄素单核苷酸FMN）作为电子介体，巧妙地结合了微生物的胞外电子转移（Extracellular Electron Transfer, EET）途径和光诱导电子转移（Photoinduced Electron Transfer, PET）过程，直接还原CTA持续产生自由基，从而在不依赖外源性引发剂的情况下实现了可控的RAFT聚合。该研究的核心创新在于通过合成生物学手段对希瓦氏菌进行基因改造，增强了其黄素的生物合成和转运能力，从而显著提高了聚合的单体转化率（>90%），并获得了低分散度（D<1.20）的聚合物。该系统适用于多种单体和CTA，并能合成结构明确的嵌段共聚物。这种合成生物学与RAFT聚合的协同整合，为可持续、可控的聚合平台开发提供了新范式。

关键技术方法概述

研究主要依托几个关键技术：1) 利用电活性微生物希瓦氏菌作为“活电极”，以其D-乳酸代谢作为电子源，通过其天然的Mtr途径（涉及CymA、MtrA、MtrC、OmcA等c型细胞色素c-Cyts）进行胞外电子转移（EET）；2) 采用合成生物学方法，在希瓦氏菌中异源表达来自枯草芽孢杆菌的黄素合成基因簇（ribADEHC）和来自铜绿假单胞菌的孔蛋白OprF（使用不同核糖体结合位点RBS调控表达），以增强内源性黄素（核黄素和FMN）的生产和分泌；3) 利用光激发机制，使微生物EET产生的完全还原态黄素氢醌（FL_hq）在蓝光（460 nm）照射下形成激发态（FL_hq*），其极低的还原电位足以通过光诱导电子转移（PET）还原CTA，产生引发聚合的自由基；4) 通过循环伏安法（CV）、紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、时间分辨荧光光谱、电子自旋共振（ESR）波谱和密度泛函理论（DFT）计算等手段验证电子转移路径和自由基生成；5) 利用凝胶渗透色谱（GPC）和核磁共振氢谱（¹H NMR）对聚合产物进行表征，并进行了高通量聚合（96孔板和384孔板）验证。

研究结果

构建基于希瓦氏菌光激发EET的黄素介导RAFT聚合体系

研究人员首先验证了仅靠野生型希瓦氏菌MR-1（以D-乳酸为碳源和电子供体）及其分泌的黄素（氧化态）无法直接引发N,N-二甲基丙烯酰胺（DMA）的聚合。热力学分析表明，完全还原的黄素氢醌（FL_hq）的还原电位（E_red(Riboflavin_hq) = -0.45 V, E_red(FMN_hq) = -0.49 V vs. Ag/AgCl）高于CTA1（2-乙基磺酰基硫代羰基磺酰基丙酸甲酯，E_red ≈ -0.7 V 至 -0.99 V），电子转移的吉布斯自由能变化（ΔG_EET > 0），表明该还原反应在热力学上不可行。

hq。还原的电子介体FL_hq与CTA1反应产生自由基（黑色箭头，左），但该还原反应在热力学上不可行。在蓝光照射下，FL_hq被激发到其激发态FL_hq*，能够通过PET将电子转移给CTA1产生自由基（绿色箭头，右）。（b）在希瓦氏菌、DMA、CTA1和外源添加黄素（核黄素RF或FMN）的混合物中，单体DMA的¹H NMR谱图，未观察到自由基聚合。而在光激发下，使用核黄素或FMN作为电子介体的聚合体系中合成的聚（N,N-二甲基丙烯酰胺）（PDMA）聚合物的¹H NMR谱图。（c）计算得到的从黄素（核黄素或FMN）到CTA1的电子转移路径的吉布斯能量分布图。'>

受黄素酶可利用激发态黄素氢醌参与光诱导电子转移（PET）反应的启发，研究团队引入蓝光（460 nm）照射。结果发现，在光照下，聚合反应得以高效进行，DMA转化率超过90%。DFT计算证实，激发态FL_hq的还原电位（E_red(Riboflavin_hq) ≈ -2.52 V, E_red(FMN_hq) ≈ -2.30 V vs. Ag/AgCl）远低于CTA，PET过程的ΔG_PET为负值（约-30至-34 kcal mol^-1），表明反应在热力学上可行。对照实验证明，单体、CTA、希瓦氏菌、黄素和光照均为必需条件。荧光猝灭、时间分辨荧光和ESR实验进一步证实了FL_hq与CTA之间的电子转移以及自由基的生成。细胞活性实验表明，该体系具有良好的生物相容性，聚合6小时后细胞存活率仍达80%以上。时序性杀细胞实验证明活细胞在整个聚合过程中持续提供电子至关重要。

黄素介导聚合的可控性验证

动力学研究表明，ln([M]₀/[M])与反应时间呈线性关系，符合准一级动力学，表明体系中活性自由基浓度恒定。分子量（M_n）随转化率线性增长且与理论值吻合，GPC谱图显示分子量分布窄，具备可控自由基聚合特征。通过原位链延伸成功合成了PDMA-b-PDMA二嵌段和三嵌段共聚物，GPC谱图显示明显的分子量位移且分布较窄（D=1.13-1.16），证明了聚合物链末端的高保真度。光开关实验表明聚合具有优异的时间控制性。体系还表现出良好的氧耐受性，这得益于希瓦氏菌对溶解氧的快速消耗。

增强黄素生物合成与转运以加速聚合

为解决野生型希瓦氏菌内源性黄素浓度低（~0.54 μM）导致聚合转化率低的问题，研究团队采用模块化合成生物学策略。他们将来自枯草芽孢杆菌的黄素合成基因簇（ribADEHC）在多种诱导型启动子（P_bad, P_tac, P_tet）控制下在希瓦氏菌中异源表达。其中，P_tet启动子驱动的工程菌株（Ptet）黄素产量最高（17.6 μM）。此外，通过引入来自铜绿假单胞菌的孔蛋白OprF（并筛选不同强度的核糖体结合位点RBS以优化表达）来增强黄素的跨膜转运。最终获得的工程菌株P-RBS4（弱RBS4控制OprF表达）能将胞外黄素浓度提升至21.7 μM，并使得1小时内的单体转化率提高到44%。对c型细胞色素（c-Cyts）敲除菌株（如ΔMtrC、ΔOmcA、ΔCymA）的研究证实了Mtr途径在电子传递至黄素过程中的关键作用。

tet, P_tac, P_bad, P_arcA控制）和孔蛋白基因OprF（受不同核糖体结合位点RBS控制）的质粒图谱。（b）量化由携带不同启动子和RBS的基因工程希瓦氏菌产生的黄素浓度。（c）在最佳诱导剂浓度和最佳RBS条件下，比较不同启动子的工程菌株触发的RAFT聚合的单体转化率。（d）c型细胞色素（c-Cyts）基因敲除对希瓦氏菌触发RAFT聚合单体转化率的影响。'>

单体普适性与嵌段共聚物合成

该聚合体系适用于多种水溶性单体（如PEGA, HEMA, TMAEMA, AOMA, AML, NIPAM, MAA）和部分水不溶性单体（如MMA，通过乳液聚合），均能获得高转化率（>93%）和低分散度（D < 1.23）的聚合物。此外，使用不同的CTA（如CTA2, CTA3）也能实现良好控制。利用该体系成功合成了多种结构明确的二嵌段（如PDMA-b-PAML, PDMA-b-PPEGA）和三嵌段共聚物，证明了其制备复杂拓扑结构聚合物的能力。

高通量聚合应用展示

得益于体系的氧耐受性和高效性，研究团队在96孔板（200 μL）和384孔板（50 μL）中成功进行了高通量RAFT聚合，即使不除氧也能获得高转化率和低分散度的聚合物。他们构建了目标聚合度（DP）从100到2000的PDMA聚合物库，所有聚合都实现了高单体转化率，即使在高DP下也保持了良好的分子量控制（D < 1.27），GPC表征显示单峰分布，证明了该体系在高通量合成和筛选聚合物库方面的应用潜力。

研究结论与意义

本研究成功开发了一种由基因工程改造的希瓦氏菌触发的RAFT聚合系统。该系统的核心在于利用微生物代谢（D-乳酸）作为电子源，通过其内源性EET途径还原自身合成并分泌的黄素（核黄素和FMN）生成FL_hq，再借助蓝光激发FL_hq产生强还原性的激发态FL_hq*，进而通过PET过程直接还原CTA产生自由基，从而引发和维持RAFT聚合。这一“光激发胞外电子转移”机制巧妙地结合了生物还原和光激发过程，利用黄素作为电子介体，克服了细胞分泌的黄素直接还原CTA的热力学壁垒，实现了自由基的持续、可控供应，从根本上避免了外源性引发剂的使用，从而消除了由此带来的末端基团异质性和链终止问题。

该研究不仅首次实现了不依赖外源引发剂的活微生物触发RAFT聚合，而且通过合成生物学手段优化了微生物的催化性能，展示了其在多种单体、CTA以及嵌段共聚物合成中的广泛应用潜力。所建立的高通量聚合平台进一步凸显了其在快速筛选和发现新型聚合物材料方面的价值。这项工作是合成生物学与可控自由基聚合深度融合的典范，为可持续、高效、可控地构建先进活性材料开辟了新的道路，有望在生物医学、环境科学、能源材料等领域产生深远影响。