IGF2BP1/HMOX1通过依赖于m6A的机制介导人类精原干细胞的命运决定及男性不育的发生

《Research》：IGF2BP1/HMOX1 Mediates Fate Determinations of Human Spermatogonial Stem Cells and Male Infertility via an m6A-Dependent Manner

人类生精干细胞（SSCs）自我更新和凋亡受Opa相互作用蛋白5（OIP5）调控，但相关信号分子和通路尚未明确。本研究发现IGF2BP1与OIP5在SSCs中相互作用，通过m6A修饰稳定HMOX1 mRNA，抑制铁死亡并维持干细胞特性。RNA测序和免疫荧光-FISH证实HMOX1是IGF2BP1的下游靶点，其稳定性影响系统Xc?功能。临床数据显示IGF2BP1基因变异与NOA风险正相关，敲低IGF2BP1或HMOX1导致SSCs增殖、自噬和铁死亡异常。 rescue实验表明HMOX1过表达可逆转IGF2BP1敲低引起的干细胞功能受损。该研究揭示IGF2BP1/HMOX1轴在SSCs命运决定和NOA发病中的关键作用，为男性不育治疗提供新靶点。

　　人类精子发生是一个复杂而精细调控的过程，涉及多种细胞类型和信号通路的协同作用。精子发生障碍是导致男性不育和亚不育的重要原因之一，而精子发生过程中的关键细胞——精子发生干细胞（SSCs）的正常发育对于维持男性生育能力至关重要。近年来，研究者们逐渐认识到SSCs的发育受到多种分子机制的调控，其中信号分子及其调控通路的作用尤为关键。然而，目前对于调控人类SSCs命运决定的信号分子及其通路的研究仍处于初步阶段，许多关键分子的机制尚未完全阐明。

本研究聚焦于一个潜在的调控因子——胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）在人类SSCs中的作用及其调控机制。通过一系列实验，我们发现IGF2BP1与OIP5存在相互作用，并且其表达在人类SSCs中具有重要影响。此外，通过RNA测序（RNA-seq）和免疫荧光-荧光原位杂交（IF-FISH）等技术，我们发现HMOX1是IGF2BP1在人类SSCs中的下游靶基因。进一步的实验表明，IGF2BP1通过调控HMOX1的m6A修饰，影响其mRNA的稳定性及蛋白表达水平，从而维持SSCs的干细胞特性并抑制铁死亡（ferroptosis）的发生。铁死亡是一种依赖于铁的程序性细胞死亡形式，其发生与细胞内的氧化应激、铁代谢失衡以及脂质过氧化密切相关，对SSCs的生存和功能具有重要影响。

研究还揭示了IGF2BP1在调控SSCs命运决定中的多重作用。例如，当IGF2BP1被沉默时，SSCs的增殖、自我更新能力以及DNA合成均受到抑制，同时细胞内的活性氧（ROS）水平和铁离子（Fe2?）含量显著上升，进一步诱导铁死亡。与此同时，IGF2BP1的沉默还导致自噬（autophagy）的减少，而自噬在维持细胞稳态和抵抗氧化应激方面具有保护作用。这一发现提示我们，IGF2BP1可能通过调控自噬和铁死亡，从而维持SSCs的正常功能。

进一步的研究表明，HMOX1在SSCs中的表达与IGF2BP1密切相关。HMOX1的表达受到IGF2BP1的调控，而其沉默则会加剧SSCs的铁死亡现象。通过构建HMOX1过表达载体，我们发现HMOX1能够部分逆转IGF2BP1沉默对SSCs增殖和干细胞特性的抑制作用，这表明HMOX1在IGF2BP1调控的SSCs命运决定中具有重要作用。此外，我们还发现，IGF2BP1通过调控SLC7A11和SLC3A2的表达，维持系统Xc?的功能，从而保护SSCs免受铁死亡的侵害。系统Xc?是细胞吸收半胱氨酸以合成谷胱甘肽（GSH）的关键通路，而GSH是细胞内重要的抗氧化物质，能够清除ROS并维持细胞的氧化还原平衡。

此外，研究还揭示了IGF2BP1和HMOX1基因变异与非阻塞性无精子症（NOA）的关联。通过对1,485名NOA患者的全外显子组测序（WES）数据进行分析，我们发现IGF2BP1基因变异在NOA患者中出现的比例显著高于健康对照组。其中，rs772084376（A191G）和rs1408130892（G46A）两个SNP位点与NOA的发生存在显著正相关，提示这些变异可能在NOA的发病机制中发挥重要作用。HMOX1的基因变异同样与NOA的发生密切相关，其表达水平在NOA患者的睾丸组织中显著降低，这进一步支持了HMOX1在维持正常精子发生中的关键作用。

本研究通过一系列实验手段，揭示了IGF2BP1在调控人类SSCs命运决定中的核心作用。IGF2BP1通过与OIP5的相互作用，调控HMOX1的表达，并进一步通过影响系统Xc?的功能，抑制铁死亡的发生。这些发现不仅加深了我们对人类SSCs调控机制的理解，也为男性不育的治疗提供了新的靶点和思路。未来，基于这些分子机制的干预策略可能为NOA患者带来新的治疗希望，例如通过靶向调控IGF2BP1或HMOX1的表达，恢复SSCs的正常功能，从而改善精子发生过程。

为了进一步验证这些分子机制的临床意义，我们分析了IGF2BP1和HMOX1在NOA患者睾丸组织中的表达情况，并发现其表达水平显著低于健康对照组。这一结果提示，IGF2BP1和HMOX1的表达水平可能成为评估NOA风险的潜在生物标志物。此外，通过免疫荧光和原位杂交技术，我们观察到IGF2BP1与HMOX1在SSCs中的共表达，进一步支持了它们在调控SSCs命运决定中的协同作用。

在实验方法方面，本研究采用了多种先进的分子生物学技术，包括RNA测序、免疫荧光、共免疫沉淀、m6A修饰分析、自噬和铁死亡相关检测等。这些技术的综合应用使得我们能够从多个层面揭示IGF2BP1和HMOX1在SSCs中的作用机制。例如，通过RNA稳定性实验，我们发现IGF2BP1的沉默加速了HMOX1 mRNA的降解，从而导致其蛋白表达水平的下降。同时，我们还利用小鼠睾丸移植实验，验证了IGF2BP1在体内调控SSCs自我更新的能力，为相关机制的研究提供了重要的体内证据。

在基因变异分析方面，我们结合了多种生物信息学工具，包括PolyPhen-2、MutationTaster、LRT、SIFT、CADD等，对IGF2BP1和HMOX1的变异进行了功能预测和保守性分析。这些分析结果显示，IGF2BP1和HMOX1的某些变异可能具有致病性，提示它们在精子发生障碍中的潜在作用。此外，我们还通过统计学方法，分析了这些变异与NOA风险之间的关联，发现某些SNP位点的频率在NOA患者中显著升高，进一步支持了它们作为NOA风险因子的假设。

本研究的结果表明，IGF2BP1通过调控HMOX1的表达和稳定性，影响SSCs的自我更新、增殖能力以及铁死亡的发生。这些发现不仅为理解人类SSCs的调控机制提供了新的视角，也为男性不育的治疗提供了新的思路。未来，基于这些分子机制的干预策略，如基因编辑技术或靶向药物开发，可能为NOA患者带来新的治疗希望。此外，这些研究结果也为进一步探索其他与SSCs命运决定相关的分子机制提供了基础。

综上所述，本研究系统地揭示了IGF2BP1在调控人类SSCs命运决定中的关键作用，以及其与NOA发生之间的潜在联系。通过深入分析IGF2BP1与HMOX1之间的相互作用及其对铁死亡和自噬的调控，我们为理解男性不育的分子机制提供了新的视角。同时，这些发现也为未来针对SSCs的治疗策略提供了理论依据和技术支持。随着对这些分子机制的进一步探索，我们有望开发出更有效的治疗手段，以改善男性不育的临床现状。