用于靶向特定GPCR对的纳米无人载体-药物偶联物

《PLOS Biology》：Nanobody-drug conjugates for targeting specific GPCR pairs

双位点纳米抗体-小分子复合物通过点击化学合成，实现G蛋白偶联受体（GPCR）对等双受体协同激活的“与”逻辑门控调控，显著提高选择性和信号强度，并适用于多受体组合的靶向治疗。

　　

具有两个不同结合位点的双位点配体为精细调控G蛋白偶联受体信号传导提供了令人兴奋的机会。最近发表在《PLOS Biology》上的一项研究利用点击化学技术制备了新型纳米抗体-小分子 conjugates，并证明了它们在共表达受体对中的逻辑门控活性，从而改善了信号传导特性。

G蛋白偶联受体（GPCRs）在调节多种生理反应中起着核心作用，是药物发现领域最重要和最具吸引力的靶点之一。过去几十年中，人们进行了大量研究以开发用于调节GPCR信号传导的小分子和肽类疗法。然而，由于GPCRs在结构上的相似性及其广泛的表达模式，实现高受体选择性和组织特异性仍然具有挑战性。最近，针对GPCRs的纳米抗体（Nbs）的发展引起了广泛关注，因为它们具有潜在的超强亲和力和特异性[1]。在这项研究中，作者提出了一种将小分子药物与纳米抗体结合的方法，创造出能够同时利用这两种治疗方式优势的双位点 conjugates[2]。虽然这一概念与已在癌症治疗中得到广泛研究的抗体-药物 conjugates 相似[3], 但纳米抗体-药物 conjugates 在 GPCR 药物发现中引入了独特的逻辑门控信号传导机制。

研究人员以一种已被充分研究的 A 类 GPCR——腺苷 2A 受体（A_2AR）为研究对象，利用他们团队之前开发的方法[4]，将小分子 A_2AR 激动剂 CGS21680(CGS) 与针对该受体表位的纳米抗体 Nb_6E 和 Nb_ALFA 结合。通过 sortase 介导的标记，在纳米抗体的 N 端引入了二苯基环辛烷探针，并通过点击化学将其与叠氮化物标记的 CGS 共价连接。同样地，也合成了 CGS-表位 conjugates，方法如之前所述[5]。利用基于荧光素酶的环腺苷单磷酸（cAMP）测定法，量化了这些 CGS-Nb 和 CGS-表位 conjugates 在野生型（WT）A_2AR 以及 N 端带有 6E/ALFA 表位标签的工程化 A_2AR 上的活性。未结合的 CGS 能够激活野生型和工程化 A_2AR，而当每个纳米抗体-表位对中的相应成分缺失时，CGS-Nb 和 CGS-表位 conjugates 的活性很低，这证实了其选择性。值得注意的是，在正确的纳米抗体-表位相互作用下，CGS-Nb/表位 conjugates 的效力提高了 25 倍以上，且信号传导持续时间更长。正交的 G 蛋白激活实验也证实了 conjugated CGS 的增强效力。重要的是，在受体表达水平较低的情况下，纳米抗体结合的 CGS 仍保持了高效力和治疗效果，而未结合的 CGS 或仅有表位标签的纳米抗体仅在高浓度下才表现出活性。这些发现突显了纳米抗体结合在促进配体结合方面的优势，尤其是在受体表达水平有限的生理环境中可能具有显著意义。

由于工程化的（带有表位标签的）受体在体内并不存在，因此串联表位-纳米抗体对主要用于证明这种结合方式在开发针对单一 GPCR 靶点的纳米抗体-小分子 conjugates 方面的优势。类似的策略也曾用于生成针对血管紧张素 II 类 1 受体（Angiotensin II type 1 receptor）的 Nb_6E-肽类 conjugates[6。当存在特定受体的纳米抗体（如针对甲状旁腺激素受体-1（PTHR1）的纳米抗体）时，生成的双位点纳米抗体-配体 conjugate 可以选择性地结合并作用于同一受体的两个不同位点，从而调节受体的构象变化[7,8]（图 1A）。然而，由于 A 类 GPCR 的细胞外结构域较小，开发能够与其结合的纳米抗体更具挑战性。因此，针对单一受体的治疗性纳米抗体-小分子 conjugates 的发展受到纳米抗体可用性的限制。那么，我们还能用这种令人兴奋的结合方法探索什么呢？

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图 1. 说明纳米抗体（Nb）-药物 conjugates 在调节单一 GPCR 或一对 GPCRs 活性中的应用。

(A) 一种肽类和纳米抗体结合后，可以同时作用于同一受体的正构位点和别构位点，从而调节下游信号传导。

(B) 由小分子（针对受体 1）和纳米抗体（针对受体 2）组成的双位点 conjugate 仅在两种受体共表达时才表现出活性。这种双重受体靶向 conjugate 可以提供更持久的活性、更强的效力，改变信号传导的偏向性，并可能具有组织特异性。该图由 BioRender.com 制作。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003483.g001

作者接下来提出了他们平台的创新应用——使用化学合成方法将小分子与针对另一种 GPCR 的纳米抗体结合，从而仅在与两种受体共表达的细胞中发挥活性。由于 Nb_PTHR1 的可用性，选择另一种 Gs-偶联受体 PTHR1 作为 A_2AR 的研究对象。研究表明，CGS-Nb_PTHR1 仅在 A_2AR 和 PTHR1 共表达时才表现出活性，显示出明显的“AND”逻辑门控特性。cAMP 应答的效力和效力取决于两种受体的表达比例以及 Nb_PTHR1 与 CGS 之间的连接链长度。同样，还合成了针对与胰高血糖素样肽-1 受体共表达的 A_2AR 的纳米抗体-药物 conjugate，同样表现出“AND”门控信号传导。这些结果共同展示了该平台在仅在不同受体共存时选择性激活 A_2AR 方面的可调性和适应性。

鉴于 A_2AR 不会招募 β-阻遏蛋白（β-arrestin），研究人员选择了另一对受体 PTHR1 和 G_i 蛋白偶联的 μ-阿片受体（MOR）来研究双重靶向纳米抗体-药物 conjugates 在调节 G 蛋白与 β-阻遏蛋白信号传导偏向性方面的潜力。他们将 MOR 激动剂 DynA8 与 Nb_PTHR1 结合，制备出的 conjugate 在 G_i2 激活和 β-阻遏蛋白 2 招募方面的效力显著高于单独使用 DynA8。与针对 A_2AR-PTHR1 的 conjugate 类似，DynA8-Nb_PTHR1 conjugate 仅在两种受体共表达时才具有活性，且其效力随 PTHR1 表达水平的提高而增强。有趣的是，DynA8-Nb_PTHR1 在 β-阻遏蛋白招募方面的效力提高了 12.5 倍，而在 G_i2 蛋白激活方面的效力仅提高了 4.8 倍，表明该 conjugate 在 G 蛋白选择性方面更具优势。这些发现表明，双位点 conjugates 可以调节与单独使用小分子不同的信号传导偏向性。

总之，Sachdev 及其同事的研究[2] 开辟了一种新的途径，通过将高效的小分子药物与超选择性纳米抗体结合，以组织特异性方式调节 GPCR 对的信号传导。数十年来积累的小分子药理学知识，以及体外结合 GPCR 的纳米抗体的快速发现[9（得益于强大的计算机模拟工具[10）和人们对 GPCRs 组织特异性分布的深入了解[11），使得这种结合策略及其“AND”门控设计为未来的 GPCR 药物发现带来了令人兴奋的前景。

参考文献