靶向抑制IGF2BP1可通过m6A依赖性机制有效抑制HBV复制

《Antiviral Research》：Targeted inhibition of IGF2BP1 effectively suppresses HBV replication via an m6A-dependent manner

HBV复制受m6A修饰调控，宿主因子IGF2BP1通过KH3-4结构域结合A1907位点的m6A修饰稳定病毒RNA，促进复制，靶向抑制该蛋白可抑制HBV体外及体内复制，为抗HBV药物开发提供新策略。

　　这项研究揭示了宿主因子IGF2BP1在乙型肝炎病毒（HBV）生命周期中的作用，特别是在调控HBV RNA稳定性方面。HBV是一种主要感染肝脏的DNA病毒，其转录模板为共价闭合环状DNA（cccDNA），这种DNA存在于感染肝细胞的细胞核内。cccDNA能够转录生成五种不同长度的病毒RNA，分别是3.5-kb、2.4-kb、2.1-kb和0.7-kb的RNA。这些RNA在病毒复制和表达中发挥着关键作用，其中3.5-kb的前基因组RNA（pgRNA）不仅是病毒逆转录的模板，同时也作为翻译核心蛋白和聚合酶（Pol）蛋白的mRNA。而2.4-kb的PreS1 mRNA则被翻译成大表面抗原（L-HBsAg），2.1-kb的PreS2/S mRNA被翻译成中等和小表面抗原（M-HBsAg和S-HBsAg）。这些表面抗原能够分布在成熟病毒颗粒（Dane颗粒）的包膜上，以及病毒丝状体上。此外，0.7-kb的X mRNA被翻译成HBx蛋白，该蛋白在cccDNA的转录调控和HBV的致癌过程中具有重要作用。

所有HBV转录物起始位置不同，但终止于同一个位置，因此它们共享相同的poly(A)尾。这一特性使得HBV RNA成为抗病毒治疗的新靶点。近年来，针对HBV RNA的创新疗法，如反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）药物，已经取得了突破性进展，为实现“功能性治愈”提供了新的可能性。然而，这些疗法的广泛应用仍面临诸多挑战，因此，深入理解HBV RNA的调控机制对于开发更有效的抗病毒药物至关重要。

N6-甲基腺苷（m6A）是一种广泛存在于真核细胞RNA中的修饰，对多种生物过程产生影响，包括mRNA的稳定性、翻译效率以及核输出。HBV RNA同样含有潜在的m6A修饰位点，其中epsilon（ε）区域的A1907位点显示出最高的m6A修饰峰。研究发现，A1907位点存在于所有HBV转录物的3'茎环结构中，但在3.5-kb HBV RNA中同时出现在5'和3'茎环结构中。然而，也有研究通过MeRIP-qRT-PCR实验未能在A1907附近检测到明显的m6A修饰峰。这表明，尽管A1907是重要的修饰位点，但其修饰状态可能受到多种因素的影响，或者需要更精确的检测方法。

在功能方面，研究发现，pgRNA的5'端m6A修饰能够增强聚合酶与ε结构的结合，从而促进pgRNA的逆转录过程。而3'端的m6A修饰则通过被m6A识别蛋白YTHDF2和YTHDF3识别，降低HBV RNA的稳定性。这些发现揭示了RNA修饰如何通过宿主因子调控病毒复制的新机制。然而，关于哪些具体的调控因子能够识别HBV RNA上的m6A修饰，仍存在许多未知之处。

IGF2BP1是一种最近被识别的关键m6A识别蛋白，它能够通过m6A依赖的方式识别和结合癌基因转录物，如c-Myc和ACTB，从而增强其在肿瘤发生和发展过程中的翻译效率。此外，IGF2BP1也被报道参与调控病毒RNA的表达，例如促进SARS-CoV-2的复制。在之前的研究中，我们通过RNA拉下实验结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，鉴定了150种与pgRNA结合的宿主因子。其中，IGF2BP1在这些候选因子中尤为丰富，提示其可能在HBV生命周期中发挥重要作用。然而，IGF2BP1是否能够识别HBV RNA上的m6A修饰并调控HBV复制，尚未有明确的结论。

为了探索IGF2BP1在HBV生命周期中的具体作用，我们采用了IGF2BP1的增效和减效模型。结果表明，IGF2BP1能够通过维持HBV RNA的稳定性，正向调控HBV的表达和复制。进一步的功能和生化分析揭示，IGF2BP1主要通过其KH3-4结构域与m6A修饰的HBV RNA结合，从而增强其稳定性。使用小分子抑制剂阻断IGF2BP1与HBV RNA的结合，能够直接抑制HBV的复制。这些发现不仅为理解参与HBV RNA后转录调控的宿主因子提供了新的视角，也为开发针对HBV的新型抗病毒药物提供了潜在的靶点。

在实验方法方面，我们采用了多种细胞培养和转染技术。HepG2细胞（ATCC）、HepAD38细胞（已发表文献）以及HepG2-NTCP细胞（由教授Kuanhui Xiang赠送）均在含有10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco改良 Eagle培养基（DMEM）中培养，培养环境为37?°C，5% CO2。HepAD38细胞在培养基中进一步添加了400 μg/mL G418硫酸盐（Amerrosco）。人源肝细胞（PHH）则在商业化定制培养基中培养，这些培养基由深圳肝生物科技有限公司提供。这些细胞模型的建立为研究HBV的复制和表达提供了可靠的平台。

在结果分析中，我们发现IGF2BP1的敲低能够显著抑制HBV感染细胞模型中的病毒复制。这表明IGF2BP1在HBV的生命周期中具有关键作用。进一步的实验表明，IGF2BP1主要通过其KH3-4结构域与m6A修饰的HBV RNA结合，从而增强其稳定性。这一发现不仅揭示了IGF2BP1在HBV RNA稳定性调控中的具体机制，也为开发针对IGF2BP1的抑制剂提供了理论依据。此外，使用小分子抑制剂Cucurbitacin B对IGF2BP1进行靶向抑制，能够有效抑制HBV的复制，无论是体外还是体内实验均显示了这一结果。这表明，Cucurbitacin B作为一种潜在的抗病毒药物，可能在未来的HBV治疗中发挥重要作用。

在讨论部分，我们进一步探讨了HBV复制与m6A修饰之间的关系。研究发现，HBV的复制受到其转录物上多个m6A修饰位点的调控，其中A1907位点的m6A修饰能够调节病毒RNA的稳定性，而A1616位点的m6A修饰则被报道能够调控HBx蛋白的表达。此外，多种m6A识别蛋白，如YTHDF2，已被研究证实与HBV复制相关。YTHDF2能够被招募到m6A修饰的A1907位点，从而影响HBV RNA的稳定性。这些发现表明，m6A修饰在HBV复制过程中具有复杂的调控网络，而IGF2BP1作为其中的关键成员，可能在这一网络中扮演重要角色。

综上所述，这项研究通过综合运用增效和减效模型，揭示了IGF2BP1在HBV复制中的关键作用。IGF2BP1通过其KH3-4结构域识别并结合m6A修饰的HBV RNA，从而增强其稳定性，进而促进HBV的表达和复制。靶向抑制IGF2BP1的Cucurbitacin B能够有效抑制HBV的复制，无论是体外还是体内实验均显示出这一效果。这些发现不仅为理解HBV复制机制提供了新的视角，也为开发新型抗病毒药物提供了潜在的靶点。未来的研究可以进一步探讨IGF2BP1与其他m6A识别蛋白之间的相互作用，以及其在HBV生命周期中的具体调控路径。此外，开发针对IGF2BP1的高效抑制剂，可能为慢性乙型肝炎的治疗带来新的希望。