对粪便进行筛查和靶向测序，以确认微生物学诊断并确定少菌型结核病的耐药性

《PLOS Global Public Health》：Screening and targeted sequencing of stool for microbiologic confirmation and drug resistance determination in paucibacillary tuberculosis

本研究在埃斯瓦蒂尼进行了一项前瞻性诊断准确性研究，评估粪便靶向下一代测序（tNGS）在涂阴肺结核诊断和耐药性预测中的应用。结果显示，使用Deeplex Myc-TB和Oxford Nanopore OND-CUST-KIT两种方法，粪便tNGS分别提高了14.1%和18.8%的病例确认率，并在57%和50%的样本中成功预测了耐药基因突变。

　　在2023年，全球范围内有大约1080万人新发了结核病，其中125万人因该病死亡，其中包括16.1万名艾滋病患者（PWH），结核病仍然是他们死亡的主要原因。在这些患者中，耐药性结核病（DR-TB）占据了新诊断病例的3.2%和先前治疗病例的16%。结核病的诊断和治疗面临着巨大挑战，尤其是在那些肺结核患者中细菌载量极低的情况，即所谓的“少菌型肺结核”或“涂片阴性肺结核”患者。这类患者由于痰液中结核杆菌数量不足以通过显微镜检测或传统痰液检测方法进行耐药性分析，因此在临床实践中常常被忽视。

为了应对这一问题，研究团队在埃斯瓦蒂尼（一个结核病高负担国家）开展了一项前瞻性诊断准确性研究。该研究涵盖了那些在痰液显微镜下未检测到抗酸杆菌（AFB）的患者，旨在评估基于粪便样本的靶向下一代测序（tNGS）技术在诊断少菌型肺结核以及预测结核杆菌耐药性方面的潜力。埃斯瓦蒂尼的结核病发病率高达每10万人350例，而多重耐药或利福平耐药的结核病（MDR/RR-TB）发病率则为每10万人18例，这表明该地区对结核病诊断和治疗的需求十分迫切。

在研究过程中，参与者提供了痰液和粪便样本。这些样本在采集后被迅速冷冻保存，并在12小时内进行处理。DNA提取采用了MP Fast DNA土壤试剂盒，以确保样本质量。随后，研究人员使用定量聚合酶链反应（qPCR）技术检测样本中结核杆菌DNA的相对含量，并通过检测循环阈值（Ct）来判断样本是否适合进行tNGS分析。在Ct值低于33的情况下，研究人员认为样本中结核杆菌DNA的含量足够用于进一步的靶向测序。

针对粪便样本的tNGS分析采用了两种不同的商业试剂盒：Deeplex Myc-TB试剂盒（基于Illumina iSeq 100平台）和ONT TB Custom Kit（基于Oxford Nanopore Technologies MinION Mk1b平台）。两种技术在不同的方面展现了其独特的优势。Deeplex Myc-TB试剂盒采用了Baym文库制备方法，通过150碱基对的配对端读取来生成测序数据，并通过内置的生物信息学分析流程进行解读。而ONT TB Custom Kit则利用了R9流细胞进行测序，通过ONT MinKnow软件进行数据处理，并结合EPI2ME Labs提供的自动化分析流程“wf-tb-amr”进行进一步的解读。

在实际操作中，研究团队发现，基于粪便样本的tNGS技术能够有效检测结核杆菌DNA，并在一定程度上提供耐药性突变的完整信息。其中，使用ONT TB Custom Kit的粪便样本中，有16/21（76%）的参与者检测到了结核杆菌DNA，且有12/21（57%）的参与者获得了完整的耐药性报告。而Deeplex Myc-TB试剂盒在粪便样本中检测到了12/20（60%）的结核杆菌DNA，并提供了10/20（50%）的完整耐药性报告。这表明，尽管两种技术在检测灵敏度和结果解读方面存在差异，但它们都能够在一定程度上提高对少菌型肺结核的诊断准确性。

研究还发现，基于粪便样本的tNGS技术在诊断中发挥了重要作用，尤其是在儿童和艾滋病患者群体中。这些患者由于无法提供足够的痰液样本，传统的痰液检测方法往往无法满足诊断需求。而粪便样本则更容易获取，并且能够为耐药性分析提供关键信息。研究团队还发现，在某些情况下，基于粪便样本的tNGS技术能够比痰液检测更快地提供诊断结果，这使得患者能够在短时间内获得有效的治疗方案。

此外，研究团队还对其他诊断方法进行了比较分析。例如，痰液样本通过Xpert Ultra检测和液体培养（BACTEC MGIT系统）来确认结核杆菌的存在，并通过药敏试验（pDST）检测对利福平（RIF）、异烟肼（INH）和乙胺丁醇（EMB）的耐药性。然而，这些传统方法在检测少菌型肺结核时存在局限性，特别是在样本量不足的情况下。相比之下，基于粪便样本的tNGS技术能够提供更全面的耐药性信息，甚至能够检测到一些传统方法无法识别的耐药性突变。

研究还发现，基于粪便样本的tNGS技术在某些情况下能够提供更准确的诊断结果。例如，在一些患者中，痰液样本的培养结果为阴性，但基于粪便样本的tNGS技术却能够检测到结核杆菌DNA，并提供耐药性信息。这表明，尽管痰液样本在某些情况下可能无法提供足够的细菌量，但粪便样本在检测结核杆菌和耐药性方面具有更高的敏感性和可靠性。

研究团队还注意到，在某些情况下，基于粪便样本的tNGS技术可能会出现误判或检测不准确的情况。例如，某些样本中结核杆菌DNA的含量较低，导致tNGS分析结果不明确，从而影响耐药性预测的准确性。此外，某些样本在不同检测方法之间可能存在不一致的情况，例如，基于粪便样本的Xpert Ultra检测到耐药性，但基于痰液样本的tNGS分析未能识别出这些耐药性突变。这种情况可能是由于不同检测方法在样本处理、数据分析和解读过程中存在差异所致。

尽管如此，基于粪便样本的tNGS技术在提高诊断准确性方面展现出了巨大的潜力。尤其是在儿童和艾滋病患者群体中，这一技术能够弥补传统痰液检测的不足，为他们提供更全面的诊断信息。此外，基于粪便样本的tNGS技术能够在短时间内提供诊断结果，这对于需要快速干预的患者来说尤为重要。研究团队还发现，该技术在资源有限的地区具有较高的适应性和可行性，能够为结核病的诊断和治疗提供重要的支持。

在实际应用中，基于粪便样本的tNGS技术不仅提高了诊断的准确性，还为耐药性分析提供了更全面的数据支持。例如，研究团队发现，该技术能够检测到一些传统方法无法识别的耐药性突变，这对于制定个体化治疗方案具有重要意义。此外，基于粪便样本的tNGS技术还能够为结核病的流行病学研究提供关键数据，帮助研究人员更好地了解耐药性传播的模式和趋势。

综上所述，基于粪便样本的tNGS技术在诊断少菌型肺结核和预测结核杆菌耐药性方面具有重要的应用价值。尤其是在资源有限的地区，这一技术能够为结核病的诊断和治疗提供更全面、更及时的支持。未来的研究需要进一步优化基于粪便样本的tNGS技术，提高其检测灵敏度和结果解读的准确性，以便更好地应用于临床实践。同时，还需要进一步比较不同商业试剂盒在实际应用中的表现，以确定最适合不同人群和不同医疗环境的技术方案。