综述：流式细胞术：干细胞研究的多功能工具

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Flow Cytometry: a versatile tool for stem cell research

流式细胞术（FC）通过多参数分析、高通量检测及稀有细胞分选能力，在干细胞鉴定与特性研究中发挥关键作用，但存在单细胞悬液制备等局限性，未来需优化仪器与标准化方法。

　　

索纳尔·M·马诺哈尔（Sonal M. Manohar）| 施里亚·乔巴尔（Shriya Chaubal）| 斯拉巴尼·穆克吉（Srabani Mukherjee）| 弗兰克·阿尔弗索（Frank Arfuso）| 阿伦·达尔马拉詹（Arun Dharmarajan）| 苏达·瓦里尔（Sudha Warrier）

印度马哈拉施特拉邦孟买维莱帕尔（Vile Parle，西区）SVKM NMIMS（被认定为）大学苏南丹·迪瓦蒂亚科学学院（Sunandan Divatia School of Science）生物科学系

摘要

从异质细胞群体中识别和表征干细胞依赖于分析细胞表面或细胞内部的特定标记物表达。这些标记物表达的分析通常使用qRT-PCR、微阵列和Western blotting等批量技术进行。尽管免疫荧光技术能够实现单个细胞中蛋白质标记物的分析，但它主要是一种定性技术。流式细胞术（Flow cytometry）可以将此类分析扩展到单细胞分辨率。此外，它还提供了快速、高通量的同时量化其他参数的能力，例如细胞的增殖能力。而且，荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）可以从异质样本中物理分离出稀有的干细胞群体。本综述讨论了流式细胞术在识别和表征各种类型干细胞方面的应用范围，并重点介绍了该领域最近的研究进展和特定方法。

引言

干细胞因其独特的自我更新能力和分化为特定细胞类型的能力而广为人知。人们对干细胞兴趣增加的主要原因是，解码它们的独特特性可能为发育生物学提供深刻的见解，并为多种退行性疾病的治疗带来希望[1]。 一种或多种特定分子（多能性或全能性标记物）的表达模式，这些分子可能是细胞表面相关抗原或细胞内转录因子，被广泛用于识别不同类型的干细胞，如胚胎干细胞、造血干细胞和间充质干细胞（MSCs）[2]。这些分子的低表达被认为是细胞分化的标志。相反，另一组分子的增加表达则表明细胞已定向分化[3]。 流式细胞术（Flow cytometry, FC）能够同时检测多个参数，并提供特定细胞群体的单个参数分布。参数指的是细胞的多种属性，如其颗粒度、大小（导致光散射）或来自探针/染料的荧光（与特定细胞成分结合）。这些荧光染料选择性地附着在细胞成分上，并根据其微环境条件显示不同的发射模式。传统的流式细胞仪可以同时检测15-20个参数。现代仪器可以同时检测多达60个参数。因此，流式细胞术是一种常用于定量评估细胞光散射和荧光特性的快速方法[4]。 流式细胞术还非常适用于评估细胞群体内的异质性以及检测稀有细胞亚群，如干细胞[5]。已经采用了多种方法来表征多种类型的干细胞。其中最常用的技术包括使用流式细胞术分析细胞表面标记物的表达，以及通过实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blotting分析基因和蛋白质表达[6]。本文进一步探讨了流式细胞术在表征各种类型干细胞方面的应用范围。

流式细胞术原理

流式细胞术起源于20世纪60年代，很快被应用于医学领域以分析哺乳动物细胞。传统的流式细胞术以其高通量能力而著称，因为它可以在一秒钟内分析大量细胞（最多可达10,000个细胞）。目前正通过引入额外的激光器和探测器以及新型荧光染料来扩展可以同时评估的参数范围。

成像流式细胞术

成像流式细胞术（Imaging Flow Cytometry, IFC）结合了流式细胞术和显微镜技术，生成高分辨率图像并进行单细胞分辨率的定量分析。这种整合有助于根据细胞的形态以及其他多个参数（如光散射和荧光特性）以及检测信号的亚细胞定位（例如细胞表面、细胞质和核区域）来表征细胞[18]。因此，这种整合实现了快速的...

利用流式细胞术表征干细胞

许多不同的分子在干细胞和体细胞中的表达存在差异，这些分子可以在特定情况下用作标记物；其中一些方法已被广泛用于识别和监测干细胞类型和/或分化阶段[6]。FACS技术的优势在于可以利用该技术识别并物理分离出非常稀有的干细胞[22]。同时，细胞周期分析也有助于揭示干细胞的增殖能力...

流式细胞术作为类器官分析的工具

类器官是由干细胞或患者来源细胞培养而成的三维体外模型，能够模拟真实器官的结构和功能。这些模型已成为研究发育、疾病和治疗反应的重要工具。因此，需要高效且定量的方法来确定这些复杂组织中的细胞类型，并在实验中可重复地应用这些方法。近年来，流式细胞术被用于分析各种类型的细胞...

基于流式细胞术的干细胞研究的最新进展

本节描述了流式细胞术在多参数分析干细胞和前体细胞方面的一些最新应用。 脂肪来源的间充质干细胞 - 最近，胎盘造血内皮细胞成功转化为造血干细胞和前体细胞[110]。从内皮细胞体外生成了功能性造血干细胞和前体细胞（HSPCs）。通过E4ORF1转导，从人类脐静脉内皮细胞中工程化了血管微环境内皮细胞（VN-ECs）...

流式细胞术的局限性

进行流式细胞术分析时，细胞必须处于单细胞悬浮状态。在获取每个细胞谱系的基因表达数据或进行FACS时会出现一些困难。尽管分配了均匀的抗体批次和采用了相同的实验方法，但在不同研究设施之间协调用于表面抗原检测的FACS程序仍存在挑战[2, 4, 121]。 此外...

用于干细胞研究的流式细胞术仪器的最新进展

本节讨论了特别适合快速分析干细胞的新世代流式细胞术仪器。 过去十年中，多项研究表明，外部因素（如剪切力、渗透压平衡、激光激发和电荷）对细胞完整性和健康的影响[129]。然而，不同细胞类型对这些条件的敏感性仍有待研究...

结论与未来展望

流式细胞术为干细胞研究提供了多种优势，如高通量分析、多参数评估特定标记物的表达以及分离纯稀有干细胞群体的能力。仍需要对这些实验方案进行严格的验证和标准化。仪器、荧光团开发和分析方法的持续进步将进一步增强流式细胞术在解析干细胞群体复杂性方面的应用... 索纳尔·马诺哈尔（Sonal Manohar）：撰写初稿、可视化、验证、软件开发、方法学设计、数据分析、概念构建。 施里亚·乔巴尔（Shriya Chaubal）：撰写初稿、数据分析、方法学设计。 斯拉巴尼·穆克吉（Srabani Mukherjee）：撰写与编辑、可视化、方法学设计。 弗兰克·阿尔弗索（Frank Arfuso）：撰写与编辑、验证、方法学设计、概念构建。 苏达·瓦里尔（Sudha Warrier）：撰写与编辑、可视化、验证、监督、项目管理。

资助

无。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢SVKM NMIMS提供www.biorender.com的访问权限以及给予的宝贵支持。