辅助协同作用：明矾和绿原酸能够增强鼠伤寒沙门氏菌感染模型中的Th1免疫反应和动物存活率

《Biological Psychology》：Adjuvant Synergy: Alum and chlorogenic acid enhance Th1 responses and survival in a Salmonella typhimurium challenge model

绿原酸与铝佐剂协同增强热灭活沙门氏菌疫苗的免疫应答，促进Th1型细胞免疫并提高抗体IgG2a/IgG比值，显著提升小鼠存活率和降低肝脏细菌载量。

　　本研究探讨了将氯ogenic酸（CGA）与传统铝盐佐剂（如明矾）结合使用，对以热灭活的沙门氏菌（HKST）为抗原的疫苗所产生的细胞和体液免疫反应的影响。研究重点在于评估这种组合是否能够克服明矾在诱导Th1型免疫反应方面的不足，从而提升对沙门氏菌的免疫保护能力。通过实验发现，CGA的加入显著增强了明矾对HKST疫苗的佐剂效应，提高了淋巴细胞增殖、迟发型超敏反应（DTH）以及抗体滴度，同时改变了IgG2a/IgG的比例，使其更偏向于IgG2a。这些变化表明，CGA与明矾的组合能够促进Th1型免疫反应，从而改善对沙门氏菌的免疫保护。此外，接受组合佐剂的组别在急性感染暴露后表现出更长的存活率，而在亚急性感染暴露后肝脏中的细菌载量更低，这进一步证明了这种组合在增强免疫反应方面的有效性。

### 研究背景与意义

佐剂是一类能够增强免疫系统对特定抗原反应的化学或生物物质。它们通过激活非特异性免疫系统，提高抗原的免疫原性，从而减少所需的抗原剂量并增强特异性免疫反应。目前，疫苗研发中广泛使用多种佐剂，包括矿物化合物、油乳剂、皂苷、免疫刺激复合物、脂质体、细胞因子、多糖及其衍生物，以及各种细菌衍生物。明矾是一种常见的、成本低廉且经过美国食品药品监督管理局（FDA）批准的佐剂，广泛用于灭活疫苗。它通过在注射部位形成一个“储存库”，缓慢释放抗原，从而促进更强且更持久的免疫反应。同时，明矾还能激活先天免疫系统，进一步增强适应性免疫反应。其作用机制包括激活树突状细胞中的NLRP3炎症小体，导致促炎细胞因子如IL-1β和IL-18的释放，以及通过受损细胞释放尿酸、ATP和DNA等危险信号，刺激免疫细胞。

尽管明矾在增强体液免疫反应方面表现出色，能够促进Th2型免疫反应，从而帮助B细胞增殖，但其在诱导Th1型免疫反应方面存在明显局限。Th1型免疫反应对于清除大多数胞内病原体至关重要，而明矾通常无法有效激活这种反应。相比之下，一些其他类型的佐剂，如基于角鲨烯的MF59、ISCOM、脂质体系统（如AS01）等，能够有效刺激保护性细胞免疫反应。然而，这些佐剂在成本、安全性或使用条件方面可能存在一定的限制。

沙门氏菌是一类 facultative intracellular 细菌，它们能够在宿主细胞内生存，并通过复杂的免疫逃避机制避免被免疫系统清除。其中，沙门氏菌typhimurium（S. Typhimurium）是免疫学研究中的重要模型，能够帮助研究人员深入了解先天和适应性免疫反应的相互作用，探索细菌的胞内生存机制以及免疫逃逸策略，从而为新型疫苗和免疫疗法的开发提供理论支持。有效的免疫保护需要细胞免疫和体液免疫的平衡，特别是在对抗胞内感染如活沙门氏菌时。然而，传统的灭活疫苗通常只能诱导较强的体液免疫反应，而无法有效激活保护性细胞免疫反应，这限制了其在预防沙门氏菌感染中的应用。

此外，活疫苗虽然能够诱导更全面的免疫反应，但它们在某些情况下可能带来副作用，特别是对于免疫系统受损的人群。而复杂的亚单位或结合疫苗则需要昂贵的制备过程，这使得它们在经济欠发达地区难以推广。因此，开发能够有效激活Th1型免疫反应的新型佐剂成为疫苗研究的重要方向之一。CGA作为一种天然的多酚类化合物，具有强大的抗氧化和抗炎作用，能够帮助预防慢性疾病，如癌症和2型糖尿病。它还表现出神经保护作用，有助于改善认知功能，包括记忆和注意力。此外，CGA还被报道能够改善高血压，通过增强血管功能。

在过敏性鼻炎的研究中，CGA被发现能够降低血清IgE水平，同时提高IFN-γ水平，这是一种在Th1型免疫反应中起关键作用的细胞因子，能够抑制Th2型细胞的增殖。这表明CGA可能在免疫反应的发展过程中促进Th1型反应。此外，在抗肿瘤研究中，CGA被证实能够调节基因表达，显著上调与免疫通路相关的响应基因（如CaN、NFATC2、NFATC2ip和NFATC3），同时增强肿瘤浸润T细胞的活性，从而提高免疫系统对肿瘤的清除能力。

尽管已有研究指出CGA在诱导Th1/Th2型免疫反应平衡和减少注射部位的氧化应激方面具有潜力，但目前尚缺乏对其作为佐剂与灭活微生物结合使用效果的系统研究。因此，本研究旨在评估CGA在疫苗开发中的佐剂特性，特别是在与明矾结合使用时，是否能够有效提升对热灭活沙门氏菌的免疫反应。由于CGA和明矾都对细胞因子谱具有影响，我们假设这种组合能够创造一个更有利于Th1型免疫反应的细胞因子环境，从而在不引起过度炎症的情况下增强疫苗的免疫效果。

### 研究方法与材料

本研究中使用的明矾（铝磷酸盐凝胶）佐剂由Razi疫苗与血清研究所（伊朗，卡贾）提供。IFN-γ和IL-4的ELISA试剂盒分别由Armanbiotech公司（伊朗）和AbD Serotec公司（美国）提供。HRP偶联的兔抗小鼠IgG和IgG2a抗体分别由RAY BioTech（美国）和AbD Serotec公司（美国）提供。CGA及其他实验材料由MilliporeSigma公司（美国）采购。实验中所使用的S. Typhimurium菌株来源于本学院细菌学实验室的细菌库。

实验设计方面，研究采用了雄性Balb/c小鼠作为实验对象，它们分别接受了两剂HKST疫苗，其中一组使用明矾作为佐剂，另一组使用CGA作为佐剂，还有一组同时使用明矾和CGA作为组合佐剂。两剂疫苗的间隔时间为两周。免疫反应和对S. Typhimurium的保护效果在第二剂疫苗接种后两周进行评估。评估指标包括淋巴细胞增殖、迟发型超敏反应（DTH）强度、抗体滴度以及IgG2a/IgG比例的变化。此外，还通过急性感染和亚急性感染模型评估了小鼠的存活率和细菌载量。

### 统计分析方法

在统计分析方面，研究采用了Kaplan–Meier方法分析小鼠的存活率，同时使用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey的后验检验来评估其他免疫相关数据。选择单因素方差分析是基于数据分布的正态性和方差齐性假设。研究设定的最小显著性水平为5%，所有结果均以均值±标准差（SD）的形式呈现。

### 实验结果与分析

实验结果显示，使用CGA与明矾组合作为佐剂的组别在免疫反应方面表现出更显著的增强效果。首先，淋巴细胞增殖能力得到了显著提升，表明这种组合能够更有效地激活T细胞，从而增强细胞免疫反应。其次，迟发型超敏反应（DTH）强度也显著提高，这进一步说明了Th1型免疫反应的增强。此外，抗体滴度的增加表明体液免疫反应也得到了显著改善，而IgG2a/IgG比例的改变则更偏向于IgG2a，这进一步支持了Th1型免疫反应的增强。

在对S. Typhimurium的免疫保护方面，CGA与明矾的组合表现出更优的效果。接受组合佐剂的小鼠在急性感染暴露后存活率更高，而在亚急性感染暴露后肝脏中的细菌载量更低。这表明，这种组合不仅能够增强免疫反应，还能够有效降低感染后的病原体载量，从而减少感染的严重性。相比之下，单独使用明矾或CGA的组别在免疫反应和保护效果方面均不如组合组别。

### 讨论

本研究首次系统评估了CGA单独或与明矾结合使用作为佐剂的效果。结果显示，CGA单独使用时，其对HKST疫苗的佐剂效应优于明矾单独使用的效果。然而，当CGA与明矾结合使用时，其对免疫反应的增强效果更加显著。这种增强主要归因于IFN-γ水平的升高、DTH反应的增强以及IgG2a/IgG比例的改善。这些变化表明，CGA与明矾的组合能够有效促进Th1型免疫反应，从而提高对沙门氏菌的免疫保护能力。

明矾作为传统佐剂，虽然在诱导体液免疫反应方面表现出色，但其在激活Th1型免疫反应方面存在局限。这种局限性可能导致疫苗在预防沙门氏菌感染时效果不佳。相比之下，CGA的加入不仅能够克服这一局限，还能够通过调节细胞因子谱，创造一个更有利于Th1型免疫反应的环境。这种环境的优化有助于提高疫苗的整体免疫效果，同时减少可能的过度炎症反应。

此外，CGA的抗氧化和抗炎特性在疫苗研究中具有重要意义。这些特性不仅能够减少注射部位的氧化应激，还能够帮助免疫系统更有效地应对感染。通过结合CGA与明矾，研究人员能够开发出一种新型的佐剂组合，从而在不增加成本和副作用的情况下，提高疫苗的免疫效果。

### 研究结论

综上所述，本研究首次探讨了CGA单独或与明矾结合使用作为佐剂的效果。结果表明，CGA与明矾的组合能够显著增强对热灭活沙门氏菌的免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫。这种增强主要体现在IFN-γ水平的升高、DTH反应的增强以及IgG2a/IgG比例的改善。此外，这种组合在提高小鼠的存活率和降低感染后的细菌载量方面也表现出显著优势。因此，CGA与明矾的组合可能是一种有效的佐剂策略，能够克服传统明矾在诱导Th1型免疫反应方面的不足，从而提高对沙门氏菌的免疫保护能力。

### 研究的贡献与未来展望

本研究的发现为疫苗研发提供了新的思路，特别是在应对胞内病原体如沙门氏菌时。CGA作为一种天然的多酚类化合物，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、神经保护和心血管保护等。这些特性使其在疫苗佐剂开发中具有广阔的应用前景。通过结合CGA与明矾，研究人员能够开发出一种既能增强体液免疫反应，又能促进Th1型免疫反应的新型佐剂组合。

此外，本研究的结果表明，CGA的加入不仅能够改善疫苗的免疫效果，还能够通过调节细胞因子谱，优化免疫反应的类型。这种优化对于预防和控制沙门氏菌感染具有重要意义，尤其是在免疫系统受损的人群中。因此，未来的疫苗研究可以进一步探索CGA与其他佐剂的组合效果，以期开发出更高效、更安全的疫苗策略。

### 作者贡献

本研究的作者分别承担了不同的研究任务。Mahtab Pourkamalzadeh负责撰写原始稿件、获取资金、进行数据分析和数据管理。Seyyed Meysam Abtahi Froushani负责撰写原始稿件、监督研究、管理项目、制定方法、获取资金以及提出研究思路。Abdolgaffar Ownagh负责验证实验结果、制定方法和进行数据分析。所有作者均对研究的完成做出了重要贡献，并确认了研究的伦理性和资金来源。

### 竞争利益声明

本研究的作者声明不存在任何竞争利益。研究过程遵循伦理规范，所有资金来源均已公开。作者确认不存在可能影响研究结果或解释的财务、个人或专业关系。研究的透明性和伦理性确保了其科学性和可信度。