Oxidantscan：一种评估镰状细胞病患者红细胞对氧化应激敏感性的新型生物标志物

《Blood Cells, Molecules, and Diseases》：Oxidantscan: A novel biomarker to assess red blood cell susceptibility to oxidative stress in sickle cell disease

镰刀型细胞贫血症（SCD）患者红细胞在氧化应激下的变形性研究及L-谷氨酰胺治疗效果评估。采用Oxidantscan技术检测T-POD（氧化应激诱导变形性起始时间）和EImin（最小变形性），结果显示HbSS（n=21）和HbSC（n=19）患者T-POD分别为729±410秒和1031±225秒，EImin为0.26±0.10和0.30±0.10，均显著低于健康对照组（n=20，T-POD 1739±328秒，EImin 0.54±0.02）。外源性L-谷氨酰胺治疗使HbSS患者T-POD缩短11.5%（p=0.01），EImin提高46.9%（p=0.03），提示Oxidantscan技术可用于氧化应激相关红细胞疾病的诊断及疗效评估。

　　

C.A. Hernández | M.J.M. Traets | W.W. van Solinge | A.W. Rijneveld | L. Kaestner | T. John | E. Nur | B.J. Biemond | F.A. Kuypers | E.J. van Beers | M.A.E. Rab | R. van Wijk

乌得勒支大学医学中心中央诊断实验室 - 研究部，荷兰乌得勒支

摘要

患有镰状细胞病（SCD）的患者的红细胞（RBC）持续暴露在高水平的氧化应激下，这会影响红细胞的变形能力。在这项研究中，我们应用了一种新技术（Oxidantscan）来测量在氧化应激作用下红细胞的变形能力。利用从SCD患者队列和健康志愿者中收集的红细胞，我们测量了多个参数，包括T-POD（氧化剂诱导的变形能力变化起始时间）和EI_Min（测试过程中达到的最小变形能力）。与健康对照组（n = 20, 1739 ± 328 s，p < 0.05）相比，HbSS（n = 21, 729 ± 410 s）和HbSC（n = 19, 1031 ± 225 s）患者的T-POD显著缩短。同时，HbSS（0.26 ± 0.10）和HbSC（0.30 ± 0.10）患者的EI_Min也显著低于健康对照组（0.54 ± 0.02）。这些结果表明，SCD患者的红细胞更容易受到氧化应激的影响，并且这种影响可以通过可重复和量化的方法进行测量。我们还发现Oxidantscan的结果参数与红细胞镰状化行为和溶血标志物相关，表明这些关键的病理生理特征与抵抗氧化应激的能力之间存在可能的联系（所有p < 0.05）。最后，我们提供了初步证据，证明这种技术可用于评估抗氧化疗法的效果——因为SCD红细胞在接受l-谷氨酰胺处理后，T-POD（11.5%，p = 0.01）和EI_Min（46.9%，p = 0.03）有显著改善。Oxidantscan是一种有前景的技术，可用于评估SCD红细胞对氧化应激的反应，为疾病的病理生理学提供了新的见解，并可能为新的治疗策略提供依据。

引言

镰状细胞病（SCD）是一种由β-珠蛋白基因点突变引起的遗传性血红蛋白病，导致产生HbS血红蛋白。与正常的成人血红蛋白（HbA）不同，HbS在脱氧后会聚合，使红细胞变成僵硬的镰刀形。这些形态变化会损害红细胞的变形能力，并导致血管内溶血，从而显著缩短红细胞的寿命[[1], [2], [3]]。SCD包括多种基因型变异，临床严重程度各不相同。HbSS基因型是最严重的形式[2]。较轻的表现见于复合杂合子形式，如HbSC病和HbS/β^+/0地中海贫血[2]。其中，HbSC和HbS/β⁺地中海贫血的临床并发症通常比HbSS和HbS/β⁰地中海贫血较轻[2]。 溶血通过释放具有氧化还原活性的游离血红蛋白、血红素和铁到循环系统中，从而促进全身氧化应激[4,5]。在生理条件下，游离血红蛋白和血红素分别由触珠蛋白和血红蛋白结合蛋白清除[4,5]。然而，在SCD中，慢性且过度的溶血会耗尽清除系统，导致未结合的血红素和Hb积累，这些物质会催化氧化反应并生成活性氧（ROS），如过氧化氢[4,5]。ROS反过来会导致内皮损伤、加速溶血、一氧化氮耗竭和促凝状态。这些病理生理机制共同作用，导致器官逐渐受损，并加剧SCD患者的慢性并发症[[6], [7], [8], [9]]。 由于ROS的易变性，测量氧化应激具有挑战性[4,5]。尽管已经开发出几种方法来研究氧化损伤对红细胞的各种影响，但没有一种方法能够以可重复的方式评估其对红细胞的功能后果。 我们之前报道了RoxyScan技术，该技术可以测量在氧化应激作用下红细胞的变形能力[10]。在本研究中，我们提出了一种改进的方法，称为“Oxidantscan”。新方法使用设备的蠕动泵自动混合样品，并使用较低浓度的氢过氧化物（CHP）——一种公认的氧化剂[[11], [12], [13], [14], [15]]，从而产生较轻、渐进的氧化挑战，促进膜脂质过氧化并损害红细胞的变形能力。 从单次测量中可以得出多个结果参数，每个参数可能反映红细胞对氧化应激反应的不同方面。该技术旨在帮助理解氧化应激对红细胞的功能后果，并可能作为监测疾病进展、开发新型靶向疗法和评估治疗效果的新方法，特别是在与氧化应激增加相关的红细胞疾病领域。 在这项研究中，我们展示了Oxidantscan在SCD中的应用潜力，通过将Oxidantscan的结果参数与SCD基因型、常规血细胞计数参数、溶血参数、氧梯度渗细胞计参数进行关联，分别在基线条件下或在使用抗氧化剂（如l-谷氨酰胺、N-乙酰半胱氨酸和维生素E）的体外处理后进行比较。我们证明Oxidantscan能够量化SCD患者的红细胞中的氧化应激。

患者样本

符合条件的参与者为就诊于门诊诊所的SCD成人患者。排除了在采血前3个月内接受过输血的患者。血液样本是在稳定状态下采集的（即非血管阻塞事件或急诊科就诊期间）。排除了接受除羟基脲以外其他治疗的患者。该研究得到了机构医学伦理审查委员会的批准（协议编号17/392），符合相关规定。

结果

共有52名SCD患者（HbSS n = 21，HbSC n = 22，HbSβ⁰ n = 4，HbSβ⁺ n = 5）参与了本研究。此外，还研究了20名健康对照组（HC）。表1列出了年龄、性别、羟基脲（HU）治疗情况及相关血液学参数的描述性基线特征。

讨论

在这项研究中，我们证明了Oxidantscan作为评估SCD红细胞对氧化应激敏感性的生物标志物的潜力。HbSS、HbSβ⁰、HbSC和HbSβ⁺患者的红细胞显示T-POD和EI_Min值显著低于健康对照组。这两个Oxidantscan参数可能与HbSS患者的镰状化倾向和溶血标志物有关。 T-POD和EI_Min可能是氧化应激对红细胞存活能力和变形能力影响的潜在指标。

CRediT作者贡献声明

C.A. Hernández：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。 W.W. van Solinge：撰写——审阅与编辑。 A.W. Rijneveld：撰写——审阅与编辑、资源提供。 L. Kaestner：撰写——审阅与编辑。 T. John：撰写——审阅与编辑、软件使用。 E. Nur：撰写——审阅与编辑、资源提供。 B.J. Biemond：撰写——审阅与编辑、资源提供。 F.A. Kuypers：撰写——审阅与编辑。

关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

我承认在准备本手稿时使用了Perplexity（https://www.perplexity.ai/）这一基于AI的工具来辅助语法审查和语言优化。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者声明本研究的研究、作者身份和/或文章发表得到了财务支持。本研究得到了欧洲框架计划“Horizon 2020”和“Horizon Europe”的资助，资助协议编号分别为860436（EVIDENCE）和101120168（INNOVATION）。 本研究得到了荷兰镰状细胞病结果研究（SCORE）联盟的支持。