综述：合成生物学技术在药用植物生物活性化合物生物合成中的高级应用

《Chinese Herbal Medicines》：Advanced applications of synthetic biology technology in biosynthesis of bioactive compounds from medicinal plants

苯甲酰异喹啉生物碱（BIAs）的结构多样性主要依赖O-/N-甲基转移酶的催化作用。本研究通过基因组分析、功能酶活验证及分子对接，在M. dauricum中鉴定出4个关键酶：MdOMT1特异性催化C7-O甲基化及C2-O甲基化，MdOMT11偏好C9-O甲基化，MdNMT3完成N2-N甲基化。基因共线性分析揭示基因组扩张事件促进酶家族分化，动力学与结构模拟显示MdOMT1/MdOMT11存在底物特异性与空间位阻差异，为合成生物学改造提供理论依据。

　　本研究围绕一种重要的植物代谢产物——苯基异喹啉生物碱（Benzylisoquinoline Alkaloids, BIAs）的合成路径展开，重点分析了参与该过程的甲基转移酶（Methyltransferases, MTs）及其功能特性。BIAs是一类广泛存在于毛茛科、罂粟科、小檗科和防己科植物中的次生代谢产物，具有显著的药理活性和生物活性，如吗啡、可待因、小檗碱等，这些化合物在治疗疾病及药物开发中扮演重要角色。然而，BIAs的结构复杂性对传统化学合成构成了挑战，因此合成生物学作为一种新兴技术，被广泛应用于其高效生产。研究团队通过对基因组、转录组和代谢组的综合分析，识别并表征了多个甲基转移酶基因，为BIAs的生物合成提供了关键的分子基础。

本研究的核心目标在于系统识别并解析BIAs生物合成过程中关键的O-甲基转移酶（OMTs）和N-甲基转移酶（NMTs）。通过结合基因组和生化方法，研究团队在已发布的毛茛根藤（Menispermum dauricum）基因组数据中进行了广泛的MT基因筛选。最终，共鉴定出75个MT编码基因，包括63个OMTs和12个NMTs。这些基因分布在22条染色体上，而第10、15、23和25号染色体上未发现相关基因。研究进一步探讨了这些MT基因的结构、功能域、保守基序以及它们的基因表达模式，为理解这些酶在BIAs生物合成中的作用提供了重要的分子依据。

通过系统性的基因组分析和比较基因组学方法，研究团队发现这些MT基因在进化过程中经历了显著的扩展。其中，部分基因的重复事件（如全基因组重复WGD和串联重复TD）可能促进了MT基因家族在毛茛根藤中的多样性与功能分化。例如，研究发现MdOMT10和MdNMT3这两个基因在染色体6和13上具有较高的表达水平，而它们的同源基因（如MdOMT35和MdNMT12）则表现出较低的表达，这表明某些基因可能保留了祖先的功能，而其他基因则经历了转录沉默。这种模式不仅揭示了MT基因在毛茛根藤中的进化动态，还为理解其在BIAs生物合成中的功能分工提供了线索。

为了进一步验证这些MT基因的功能，研究团队采用体外酶活性实验，使用多种BIAs前体作为底物，分析它们的甲基化特性。结果显示，四类关键酶（三种OMTs和一种NMT）在BIAs的结构多样化过程中发挥了重要作用。其中，MdOMT1对1-苯基异喹啉（1-BIAs）和四氢原小檗碱（tetrahydroprotoberberines）的C7和C2位点表现出显著的O-甲基化偏好。而MdOMT11则对（S）-四氢原小檗碱中的C9位点表现出更强的亲和力和选择性。此外，MdNMT3在对1-BIAs和四氢原小檗碱的N-甲基化过程中表现出高效性。这些发现不仅明确了OMTs和NMTs在BIAs生物合成中的具体作用，还揭示了它们在不同代谢途径中的分工。

值得注意的是，研究团队通过分子对接和酶动力学分析，进一步探讨了MdOMT1和MdOMT11在底物结合模式上的差异。结果显示，MdOMT11的结合口袋具有独特的结构特征，使其能够高效地识别并结合特定的底物结构，而MdOMT1的结合口袋则具有较大的体积和更广泛的底物适应能力。这种结构差异与它们的催化效率和选择性密切相关，MdOMT11在低浓度底物条件下表现出更高的亲和力，而MdOMT1则在高浓度底物环境下展现出更高的催化能力。这一发现不仅加深了对这两种酶在催化机制上的理解，还为它们在合成生物学中的应用提供了理论支持。

在NMTs方面，研究团队同样进行了深入的分析。他们发现，MdNMT3在N-甲基化过程中表现出高度的催化活性，能够依次对（S）-可可碱（coclaurine）和（S）-N-甲基可可碱进行甲基化，生成不同的产物。此外，MdNMT3还表现出对（S）-四氢原小檗碱的N-甲基化能力，表明其具有广泛的底物适应性。这些结果支持了NMTs在BIAs生物合成中的关键作用，并揭示了它们在不同代谢途径中的功能差异。

本研究还探讨了OMTs的催化特异性与底物适应性。通过使用19种不同的BIAs底物，研究团队发现MdOMT1不仅能够催化1-BIAs和四氢原小檗碱的O-甲基化反应，还能够对一些特定的中间产物进行二次甲基化。例如，当使用四氢原小檗碱作为底物时，MdOMT1能够催化其在C7和C3'位点的O-甲基化，生成新的产物。这种催化模式与之前在防己属植物中发现的S9OMT（如SiSOMT）具有相似性，说明OMTs在BIAs的结构多样化过程中可能遵循一定的保守机制。然而，由于缺乏标准品和NMR分析的限制，研究团队在某些单甲基化产物的结构确认上存在一定的困难，但高分辨率的MS/MS数据为这些产物的鉴定提供了有力支持。

此外，研究还发现，虽然MdOMT1表现出较高的催化灵活性，但MdOMT11在底物选择性上更为严格，仅对特定的底物（如（S）-四氢原小檗碱）表现出高效的催化能力。这种酶的特异性在合成生物学中具有重要价值，因为其能够更精确地控制甲基化反应，从而提高产物的纯度和效率。相比之下，MdOMT1的广泛底物适应性使其在生物催化过程中具有更大的灵活性，这为合成多样化的BIAs提供了可能性。

研究还探讨了MTs在不同代谢途径中的催化特性。例如，OMTs在BIAs的O-甲基化过程中表现出不同的催化模式，而NMTs则在N-甲基化过程中展现出独特的功能。通过比较不同植物中的MTs，研究团队发现，尽管某些MTs具有相似的系统发育关系，但它们的催化能力却存在显著差异。这表明，基因的进化并非完全决定了其功能，而是需要结合生化实验来验证其实际催化活性。

综上所述，本研究通过系统分析毛茛根藤的基因组数据，结合生化实验和分子对接技术，成功鉴定了多种OMTs和NMTs，并揭示了它们在BIAs生物合成中的具体作用。研究结果不仅为理解BIAs的结构多样性提供了新的视角，还为合成生物学在BIAs生产中的应用奠定了基础。未来的研究可以进一步探索这些酶的催化机制，以及它们在不同代谢途径中的功能分工，从而推动BIAs的高效合成与工程化生产。