综述：微生物生物合成靛红（indirubin）方面的进展

《Chinese Herbal Medicines》：Advances in microbial biosynthesis of indirubin

吲哚生物合成中微生物技术、酶工程优化及发酵条件调控显著提升吲哚卡巴оз??产量，但仍面临异构体分离难、代谢效率低及产业化瓶颈。解决方案包括构建多酶协同体系、开发智能发酵调控及绿色分离工艺。

　　### 植物提取与化学合成的局限性

Indirubin（靛玉红）是一种具有显著药理活性的双吲哚生物碱，因其抗白血病、抗炎和免疫调节特性而受到制药领域的广泛关注。然而，目前其主要生产方式仍依赖于植物提取和化学合成。这两种方法都面临诸多挑战。首先，植物提取过程复杂，提取物中靛玉红的含量极低（通常低于0.1%），且其水溶性差，导致提取和分离过程成本高昂，产率低下，难以满足大规模临床需求。其次，化学合成虽然在一定程度上提高了产率，但仍存在两个主要问题：一是合成过程中会产生大量副产物，如靛蓝和靛玉红异构体，这些副产物难以分离，影响最终产品的纯度和药效；二是该方法依赖有毒试剂和剧烈的反应条件，不仅对环境造成严重压力，也增加了经济成本。这些传统生产方式的局限性严重阻碍了靛玉红在临床开发和广泛应用中的进一步推进。

因此，如何实现靛玉红的绿色高效生产，已成为科研人员关注的焦点。近年来，生物合成技术逐渐成为化合物合成的关键技术路线，其核心优势在于环境友好性、产物特异性以及资源可持续性。与依赖高温、高压和有毒催化剂的化学合成过程相比，现代生物合成技术依托于基因工程、代谢调控和合成生物学的发展，能够在温和的反应条件下通过构建高效的微生物细胞工厂实现目标活性分子的定向合成。这种方法不仅显著降低了生产过程中的能耗和污染物排放，还有效避免了化学合成中常见的副产物形成，从而大大提高了产物纯度和生产安全性。

### 生物合成路径与关键酶

靛玉红的生物合成路径在实验室研究中已被逐步揭示。其主要前体包括葡萄糖和色氨酸，其中葡萄糖通过糖酵解途径转化为吲哚-3-甘油磷酸（IGP），而色氨酸则通过色氨酸合成酶（trpA/trpB）催化生成。吲哚作为整个合成路径中的核心化合物，主要由IGP通过色氨酸合成酶（trpA）生成，或通过细菌自身存在的色氨酸酶（tnaA）从色氨酸中产生。

在靛玉红的合成过程中，有三种主要的路径：一是通过氧化酶（如FMO、CYP71B102、PAMO和P450 BM-3）催化吲哚形成2-羟基吲哚和3-羟基吲哚，随后通过偶联反应生成靛玉红；二是通过氧化2-羟基吲哚和3-羟基吲哚分别生成2-酮吲哚和3-酮吲哚，这些化合物随后发生缩合反应生成靛玉红；三是通过特定酶催化吲哚氧化生成异吲哚（isatin），随后异吲哚与3-酮吲哚或3-羟基吲哚发生反应生成靛玉红。

值得注意的是，在异吲哚与3-羟基吲哚的反应过程中，以及涉及两种羟基吲哚的偶联反应中，可能会产生靛蓝这一副产物。靛蓝是靛玉红的异构体，与靛玉红具有相似的化学性质。因此，如何控制副产物的形成，提高靛玉红的合成效率，成为当前研究的重点。

在这些合成路径中，关键酶包括单加氧酶和双加氧酶系统。单加氧酶系统如FMO、TMO、PAMO和CYP450酶，它们在催化过程中需要还原等价物如NADH或NADPH，并通常依赖于细胞色素P450、黄素蛋白或金属离子（如铜和铁）作为催化中心。通过结构修饰或定向进化，这些酶的催化效率和产物选择性得到了显著提升。例如，来自*Methylobacterium extorquens*的bFMO突变体（K223R/D317S）不仅提升了催化效率，还显著提高了靛玉红的产量，达到860.7?mg/L。此外，研究还表明，通过优化基因表达系统和发酵条件，可以进一步提升这些酶的性能。

双加氧酶系统如萘二加氧酶（NDO）在靛玉红的合成中也发挥着重要作用。NDO能够催化吲哚转化为多个中间产物，如3-羟基吲哚、异吲哚和2-酮吲哚。然而，目前对于双加氧酶系统的催化机制研究尚不充分，其潜在优势仍有待进一步探索。因此，未来的研究应着重于深入分析其底物识别和氧活化机制，为高选择性突变体的设计提供理论指导。同时，开发与双加氧酶系统高度兼容的两相发酵或原位提取工艺，有助于实现实时产物分离，减轻副产物抑制，并简化下游纯化过程。

### 工程化微生物的构建与优化

为了实现靛玉红的高效合成，研究者们选择了多种工程化微生物作为宿主，包括大肠杆菌（*Escherichia coli*）、酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）和枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）。其中，大肠杆菌因其遗传背景清晰、基因操作成熟和快速增殖能力，成为实验室阶段快速验证合成路径的首选。然而，由于色氨酸作为靛玉红合成的前体具有一定的毒性，它会抑制大肠杆菌的生长，从而影响靛玉红的产量。因此，提高大肠杆菌对色氨酸的耐受性成为提升合成效率的关键。

酵母在靛玉红的合成中也展现出一定的潜力。其优势在于快速增殖、清晰的遗传框架、成熟的基因编辑技术以及完善的后翻译修饰途径，有助于表达需要修饰的关键酶。然而，酵母的重组蛋白产量较低，且培养基成本较高，这在一定程度上限制了其在大规模工业生产中的应用。此外，酵母在发酵过程中可能产生乙醇等副产物，影响其自身生长和产物合成，从而降低其经济可行性。

相比之下，枯草芽孢杆菌因其天然分泌能力和FDA认证的安全性，成为药物级生产更具有竞争力的宿主。然而，目前关于枯草芽孢杆菌在靛玉红合成中的研究仍较为有限，其代谢途径和调控机制尚未完全阐明，这在一定程度上限制了其进一步的工程化和应用。此外，假单胞菌（*Pseudomonas putida*）因其低营养需求、快速增殖能力和对氧化反应的高度耐受性，逐渐成为重要的工业微生物底盘细胞。研究发现，即使在仅表达m-甲苯酸二加氧酶或p-邻苯二甲酸二加氧酶的情况下，重组假单胞菌仍能将吲哚羧酸转化为有色产物，这表明其代谢网络具有高度的冗余性和可塑性，为靛玉红的绿色生物制造提供了广阔前景。

为了提高工程化微生物的性能，研究者们采取了多种策略。在实验室阶段，优先选择大肠杆菌进行合成路径的快速构建。在中试阶段，若以成本优势为主要目标，则应优化大肠杆菌对色氨酸的耐受性；若以安全性为优先考虑，则应探索枯草芽孢杆菌的分泌途径。在制药级工业生产中，枯草芽孢杆菌因其安全性和分泌优势，成为更具竞争力的宿主。而假单胞菌则在基因工程修饰后，可作为特定底物（如吲哚羧酸）的补充宿主。

### 基因工程与代谢工程的协同优化

基因工程在靛玉红的生物合成中发挥了重要作用。例如，Hart团队在1992年成功将*Rhodobacter sphaeroides*的基因克隆到大肠杆菌中，利用其内源的色氨酸酶将色氨酸转化为吲哚，随后由该基因编码的酶催化吲哚转化为靛玉红，这是靛玉红异源合成的首次成功尝试。此后，研究者们不断探索基因克隆和质粒构建的新方法，以提高靛玉红的产量。例如，通过克隆新的黄素还原酶基因*MoxB*并结合过表达*tnaA*和*tnaB*，研究团队构建了新的质粒pTre-TAB，显著提升了靛玉红的产量。

在基因工程与代谢工程的协同优化方面，研究者们采取了多种策略。例如，通过多基因共表达和协同调控，可以提高关键酶的活性和产物选择性。此外，CRISPR-Cas9技术被用于精准编辑宿主菌的基因组，以消除竞争性代谢途径中的基因，从而减少代谢分流并提高代谢通路的优化。例如，Sun团队构建了经典菌株W1，并通过调控启动子（如P tac）表达黄素单加氧酶基因*bFMO*，最终生成工程菌株W2和W3，其中W3实现了高达860.7?mg/L的靛玉红产量，这是目前文献报道的最高产量。

然而，当前的代谢工程研究仍面临一些挑战。首先，多基因共表达可能增加宿主菌的代谢负担，导致生长速率下降。其次，代谢通路的调控精度仍需进一步提高，部分基因的敲除可能导致中间代谢物的积累，进而抑制关键酶的活性。第三，辅因子的供应与需求之间存在不平衡，NADPH的消耗速率通常超过其再生速率，从而阻碍羟基化反应的进行。为了解决这些问题，未来研究应重点整合动态调控技术（如CRISPRi）与辅因子回收系统，以实现更精确的代谢调控和更高效的辅因子利用。

### 生物合成过程与下游纯化技术

随着绿色化学和生物技术的发展，优化靛玉红的生物合成过程成为提高生产效率和降低成本的关键。通过微生物发酵、酶工程和代谢工程，研究人员正在探索更高效且环境友好的生产方法，同时提高产物的纯度和稳定性。

在生物合成条件的优化方面，前体物质的调控是一个核心策略。色氨酸作为最重要的前体，直接影响最终产物的产量。前体调控可以通过两种方式实现：一是直接外源添加色氨酸以补充代谢通路中的底物；二是通过信号分子间接调控前体供应。例如，研究发现，氢硫化物（H?S）供体（如NaHS）可以显著提升*Isatis indigotica*中多个上游关键酶基因（如*BcSK*和*BcDXR*）的表达，从而优化前体供应。此外，研究还表明，控制添加浓度在最优范围内，避免反馈抑制，是提高靛玉红产量的关键。

在生物合成参数的调控方面，pH、温度、溶解氧水平和诱导时机对靛玉红的产量和选择性具有决定性影响。动态调控这些参数是发酵工艺优化的核心。例如，研究发现，温度梯度策略可以有效促进微生物的增殖并激活单加氧酶的活性。通过在发酵初期维持30?°C，促进微生物增殖，随后在后期将温度提升至37?°C，可以加快吲哚羟基化反应速率并缩短整体发酵周期。此外，pH梯度调控也被用于优化反应条件。在*TfdB-JLU*工程菌的发酵过程中，初始pH设置为7.0以支持微生物生长，随后调整至6.5以减少副产物的形成，从而提高靛玉红的选择性。

溶解氧水平和补料策略对发酵效率和产物组成具有显著影响。低浓度的溶解氧可以抑制氧化副反应（如靛蓝的形成），而高浓度则有利于单加氧酶的活性。因此，维持适当的溶解氧水平是确保微生物正常生长和代谢的关键。在发酵过程中，通过调节搅拌速度和通气速率，可以优化酶活性和产物稳定性。例如，在使用葡萄糖作为碳源的靛玉红合成研究中，研究人员成功将溶解氧水平维持在30%至50%之间，从而实现了高效的靛玉红合成。此外，研究还表明，通过优化补料策略（如控制葡萄糖浓度在2?5?g/L范围内），可以防止醋酸等副产物的积累。

诱导时机的精准选择对于靛玉红的合成效率和产物特异性至关重要。过早或过晚的诱导可能导致产物产量下降，因此需要根据不同系统的细胞生长和代谢特性进行优化。在微生物发酵过程中，通常在对数生长期的中期进行诱导，以平衡细胞生物量和酶活性表达。例如，天津大学在获得黄素单加氧酶突变体L701和S321T后，通过在600?nm光密度值为1时进行诱导，显著提高了靛玉红的合成效率。诱导后，靛玉红在16?h内迅速积累，产量在60?h时达到峰值（40.1?mg/L）。值得注意的是，靛蓝作为竞争性副产物，通常在诱导后10?h开始形成，早于靛玉红的合成高峰。因此，延迟诱导或采用分阶段诱导策略，可以有效抑制靛蓝路径，延长靛玉红的合成窗口，从而提高产物特异性和最终产量。

在植物系统（如*Isatis indigotica*的毛状根培养系统）中，诱导时机的选择主要集中在刺激次级代谢活性上。通常在培养14?21?d后加入诱导剂，此时生物量进入稳定期，靛玉红的合成能力最强。研究表明，结合16?h光照/8?h黑暗周期的调控，可以同时促进毛状根生长和靛玉红合成，显示了光信号在植物宿主中的协同调控作用。

### 产物富集与纯化技术

靛玉红的分离与纯化技术在传统方法中主要依赖于柱层析和溶剂结晶。其中，氧化铝柱层析因其高吸附能力和成本效益，成为实验室规模纯化靛玉红的主要技术。研究表明，使用干柱层析（Al?O?）并采用氯仿-乙酸乙酯（10:3）梯度洗脱，可以实现靛玉红纯度达到97.5%至98%。湿柱层析则通过动态吸附平衡进一步缩短分离时间至4?h。然而，氧化铝的频繁再生需求限制了其在工业应用中的可行性。

为了应对工业规模的需求，大孔吸附树脂技术因其基于吸附的分离方式而展现出良好的应用前景。该技术通过大孔树脂的高比表面积和选择性吸附能力，实现了靛玉红的高效分离。典型的分离过程包括吸附、杂质洗涤和解吸三个步骤。在*Polygala japonica*（日本木蝴蝶）复合制剂的分离过程中，12-1树脂对靛玉红的吸附能力为0.256?mg/g，纯化因子可达9.2。该技术的优势在于处理量大、操作简便、树脂可回收且成本相对较低，使其特别适合工业规模生产。然而，树脂类型选择、再生性能和服务寿命等因素直接影响分离效率和经济性，需要根据具体应用场景进行优化。

膜分离技术近年来也被应用于靛玉红的生产。在*Isatidis Radix*（靛蓝根）的提取过程中，分子量截留为30,000的超滤膜能够通过尺寸排阻效应保留靛玉红于截留液中。当结合多步乙醇提取时，该方法的转移率可达32.86%，比传统药典方法提高了13.91%。此外，膜分离技术能够有效避免高温处理导致的靛玉红降解（其热稳定性临界温度约为80?°C）。然而，膜污染问题仍需通过每两小时的反冲洗操作加以解决。结合超滤和真空浓缩的集成工艺，可将能耗降低约40%，同时通过优化干燥温度（45?°C相比60?°C），将靛玉红含量从0.12%提升至0.35%。尽管如此，膜材料的成本（如聚醚砜膜每平方米约200美元）仍然是大规模应用的主要障碍。

### 两阶段发酵技术的应用与挑战

两阶段发酵技术在靛玉红的生产中表现出显著的优势。该技术将微生物的生长阶段与产物合成阶段分开，从而优化不同环境条件下的代谢过程。在生长阶段，通过优化碳源和代谢通路，工程菌株能够快速积累生物量。例如，在发酵阶段，工程菌株W3能够在优化条件下高效地将底物转化为靛玉红，最终实现860.7?mg/L的产量和18?mg/(L·h)的生产速率，比之前报道的最高产量提高了3.43倍。此外，通过控制溶解氧水平（生长阶段维持50%，生产阶段降至10%以下），可以有效抑制靛蓝的形成。

动态调控技术的引入进一步提升了两阶段发酵的效率。例如，温度响应系统（如SIMTeGES系统）能够在30?°C下促进微生物生长，而在25?°C下激活产物合成基因，从而避免对外源诱导剂的依赖。此外，代谢负担平衡策略利用阻遏物（如TetR）在生长阶段抑制合成基因的表达，待生物量达到一定水平后解除这一压力。厦门大学通过两阶段溶解氧控制策略（生长阶段维持50%，生产阶段降至10%），将靛玉红的选择性从15%提升至60%，同时将总产量提高至120?mg/L。此外，通过DNA合成抑制剂等细胞周期同步技术，可以实现微生物群体在生产阶段的同步进入，从而提升合成效率约20%。

尽管两阶段技术在靛玉红的生产中具有诸多优势，如缓解代谢资源竞争、提高产物纯度（如泡沫浮选法可将靛玉红的回收率提升至75%）以及减少石灰的使用以实现绿色生产，但其在工业应用中仍面临一些挑战。这些挑战包括对高灵敏度传感器（如联用近红外光谱）的依赖以实现精确的动态控制，基因元件泄漏可能导致的菌株稳定性问题，以及在大规模生产中因混合不均而产生的质量转移限制。未来的研究应集中于合成生物学工具（如双菌株共培养中的分工合作）、利用机器学习的智能发酵系统，以及开发专门的底盘生物（如使用酵母代替大肠杆菌）。通过整合不同规模的工艺流程并创新绿色生产模型，两阶段技术有望推动基于靛蓝的生物制造技术突破，为天然药物和染料行业提供高效且可持续的生产路径。

### 未来展望与挑战

尽管靛玉红的生物合成展现出广阔的前景，但在技术实现和产业化过程中仍面临关键挑战，主要集中在四个方面：副产物控制、代谢效率、产学研脱节以及制药合规性。

首先，靛蓝与靛玉红作为结构异构体，在发酵液中共同存在。传统分离技术存在分辨率低、成本高的问题，而当前工业纯化仍依赖昂贵的制备色谱，导致效率低下。因此，如何高效且低成本地分离靛蓝和靛玉红，是当前研究的重要方向。

其次，现有工程菌株在代谢通路效率方面仍存在不足。例如，工程菌株对NADPH的依赖性较高，外源途径可能引发代谢失衡，膜通透性限制了底物的摄入，而产物的毒性可能抑制宿主的生长。因此，当前最高产量（40.1?mg/L）与工业经济阈值（>1?g/L）之间存在显著差距。为了提高代谢效率，未来研究应加强代谢调控和通路设计，应用动态调控技术（如CRISPRi）构建智能系统，以实时感知中间产物（如吲哚）并调控竞争性代谢途径基因的表达，平衡代谢流并降低宿主负担。此外，通过定向进化关键酶（如P450酶和糖基转移酶）可以进一步提升催化效率和特异性。

第三，产学研之间的脱节是限制靛玉红生物合成技术产业化的重要因素。上游基础研究（如酶机制分析和通路设计）与下游工艺放大（如发酵工程和分离纯化）之间的协同不足，阻碍了实验室成果向商业产品的转化。因此，未来研究应加强跨学科创新策略，系统优化合成效率、选择性和经济性。

最后，制药合规性要求是靛玉红生物合成面临的关键挑战之一。作为药品成分，生物合成的靛玉红必须符合严格的制药标准（如杂质谱控制、残留检测和生物等效性认证），但相关研究仍显不足。因此，未来应利用绿色高效的合成方法，确保活性成分的高纯度、高产率和批次稳定性，并根据国际制药标准优化纯化过程和质量控制系统，以满足安全、有效性和质量一致性的要求。

总之，靛玉红的生物制造正处于从实验室向工业化的关键过渡阶段。深入整合合成生物学、酶工程和工艺工程，有望建立高效、绿色且符合法规的生产流程，为临床实践提供高纯度、低成本的靛玉红，并推动生物制造产业的升级与发展。