病毒表达载体对模式植物和非模式植物中的功能增强分析具有不同的影响

《Current Plant Biology》：Viral expression vectors differentially impact gain-of-function analyses in model and non-model plants

棉花基因过表达研究：TRV与CLCrV载体效能对比

　　棉花（*Gossypium hirsutum*）作为全球最重要的纤维作物，其应用范围广泛，从纺织品到医疗用品，再到工业用纤维和货币制造。然而，棉花在基因改良方面的挑战性以及较长的生命周期，使其在功能分析和遗传改良机制探索上受到限制。因此，开发高效的遗传工具对于推动棉花研究至关重要。植物病毒，尤其是病毒诱导基因沉默（VIGS）技术，已成为研究棉花生物学的重要手段。其中，烟草脆裂病毒（TRV）和棉花叶皱缩病毒（CLCrV）是两种被广泛应用的病毒工具，分别用于基因沉默和功能增强分析。尽管TRV在模式植物如*Nicotiana benthamiana*中表现优异，但在棉花中的应用却存在局限性。相比之下，CLCrV在棉花中展现出更稳定的系统性基因表达能力。本研究旨在探讨TRV和CLCrV在棉花中的功能增强潜力，并分析其在非模式植物中的适用性。

### 棉花的基因改良挑战

棉花在全球农业生产中占据重要地位，其产量和应用价值使得其成为研究的重点对象。然而，棉花的基因改良面临多重挑战。首先，其复杂的基因组结构和多倍体特性使得传统的转基因技术难以有效应用。其次，棉花的生命周期较长，从播种到收获通常需要90天以上，这限制了基因功能研究的效率。此外，棉花对某些基因编辑工具的响应能力较弱，这使得研究者在探索棉花基因功能时面临较大困难。因此，寻找替代性的高效基因操作工具成为研究的重要方向。

### 病毒工具的应用与局限性

植物病毒作为基因操作工具，具有许多优势。首先，病毒可以快速在植物中传播，从而实现系统性基因表达。其次，病毒介导的基因沉默技术（VIGS）能够在短时间内实现目标基因的高效抑制，为研究基因功能提供了便利。TRV和CLCrV是两种常用的病毒工具，分别用于基因沉默和功能增强。TRV是一种双分体RNA病毒，其RNA 1编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）、运动蛋白（MP）和一个16kDa的非结构蛋白，而RNA 2则编码病毒衣壳蛋白（CP）、ORF 2b和ORF 2c。其中，ORF 2b对于病毒通过线虫传播至关重要，而ORF 2c则与病毒的复制和表达有关。为了实现功能增强，TRV的RNA 2被改造，其中ORF 2b被删除，替换为来自相关病毒*Pea early browning virus*（PEBV）的启动子，从而驱动目标基因的表达。此外，TRV还保留了一个多克隆位点（MCS），便于插入目标基因。

相比之下，CLCrV是一种双分体DNA病毒，其DNA-A编码病毒复制和包装所需的蛋白质，如Rep、REn和TrAP，而DNA-B则编码运动蛋白（MP）和核穿梭蛋白（NSP）。为了实现功能增强，CLCrV的DNA-B保持不变，而DNA-A中的衣壳蛋白（CP）被移除，并替换为MCS，以增加基因插入的空间。此外，CLCrV的病毒衣壳蛋白（CP）大小约为755个核苷酸，限制了其在病毒基因组中携带较大基因的能力。因此，研究者通常需要在病毒基因组中插入较小的基因片段，以确保病毒的稳定性和传播能力。

### TRV和CLCrV在棉花中的功能增强表现

为了比较TRV和CLCrV在棉花中的功能增强能力，研究者分别构建了TRV和CLCrV的基因增强载体，并在棉花和*Nicotiana benthamiana*中进行了测试。在*Nicotiana benthamiana*中，TRV的基因增强载体能够稳定地将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因传递到系统性叶片中，并且在22天后仍能观察到较强的荧光信号。这表明TRV在模式植物中具有良好的系统性基因传递能力。然而，在棉花中，TRV的基因增强载体表现不佳，EGFP的表达仅限于接种部位附近的叶片，未能实现系统性传播。相比之下，CLCrV在棉花中能够稳定地将EGFP传递到系统性叶片，并且在46天后仍能观察到明显的荧光信号。此外，CLCrV还能够将*GhSFT*（单花托基因）传递到棉花的末端叶片，诱导开花，而TRV则未能实现这一效果。

### 病毒载体的构建与测试

为了构建TRV的基因增强载体，研究者基于pYL156载体进行了改造。首先，移除了ORF 2b，保留了ORF 2c，并在RNA 2的5'端插入了PEBV启动子。这一设计使得病毒能够驱动EGFP的表达，并且保留了MCS，便于插入其他目标基因。此外，为了进一步提高基因传递效率，研究者还构建了TRV:GhSP:PEBVp:EGFP载体，其中*GhSP*（自我修剪基因）被用作沉默信号，以减少目标基因的表达部位，从而增强病毒的系统性传播。然而，即使经过这些优化，TRV在棉花中的系统性基因传递仍然不如CLCrV。

在测试过程中，研究者将EGFP基因插入到TRV和CLCrV的载体中，并分别在棉花和*Nicotiana benthamiana*中进行接种。在*Nicotiana benthamiana*中，EGFP的表达在22天后仍然稳定，而在棉花中，EGFP的表达仅限于接种部位附近的叶片，未能在系统性叶片中检测到明显的荧光信号。此外，TRV的基因增强载体在棉花中未能诱导开花，而CLCrV则成功地将*GhSFT*基因传递到棉花的末端叶片，导致早期开花和更确定的植物结构。

### 病毒传播与基因表达的系统性分析

为了进一步分析TRV和CLCrV在棉花中的传播能力，研究者使用了荧光显微镜和RT-qPCR技术。在*Nicotiana benthamiana*中，TRV的基因增强载体能够实现系统的基因传递，EGFP的表达在22天后仍然明显。而在棉花中，TRV的基因增强载体未能实现系统的基因传递，EGFP的表达仅限于局部区域。相比之下，CLCrV在棉花中能够实现系统的基因传递，EGFP的表达在系统性叶片中持续存在，并且呈现出血管特异性分布。这一现象可能与CLCrV的DNA复制和转录机制有关，因为其在细胞核内进行复制和转录，随后将RNA运输到细胞质中进行翻译。而TRV作为一种RNA病毒，其复制过程可能受到更多限制，导致系统性传递效率较低。

此外，研究者还测试了TRV和CLCrV在棉花中诱导开花的能力。CLCrV能够将*GhSFT*基因传递到棉花的末端叶片，导致植物提前开花并形成更确定的结构。然而，TRV的基因增强载体未能实现这一效果，导致植物继续进行营养生长，未能进入生殖阶段。这一结果表明，CLCrV在棉花中具有更强的系统性基因传递能力，而TRV则存在一定的局限性。

### 病毒工具在非模式植物中的适用性

本研究的发现对于植物病毒工具在非模式植物中的应用具有重要意义。虽然TRV在模式植物中表现出良好的系统性基因传递能力，但在棉花等非模式植物中，其效果有限。这提示研究者在选择病毒工具时，需要考虑其在不同植物中的适用性。例如，CLCrV在棉花中表现出更强的系统性传递能力，可能更适合用于棉花的基因功能研究。然而，CLCrV在携带较大基因片段方面也存在限制，因此需要在病毒载体设计上进行优化，以提高其在非模式植物中的应用范围。

此外，研究者还发现，TRV的基因增强载体在棉花中未能实现系统的基因传递，可能与病毒的传播能力和基因组容量有关。为了提高TRV在棉花中的应用效果，可能需要对病毒的结构和复制机制进行进一步的优化。例如，通过调整病毒的启动子或基因插入位置，以提高其在非模式植物中的表达效率。

### 未来研究方向与应用前景

本研究的结果表明，虽然TRV在模式植物中具有较高的系统性基因传递能力，但在棉花等非模式植物中的应用仍存在挑战。因此，未来的研究需要探索更高效的病毒工具，以克服这些限制。例如，开发新的病毒载体，以提高其在非模式植物中的传播能力和基因表达效率。此外，还需要进一步研究病毒在不同植物中的适应性，以确定其在非模式植物中的最佳应用条件。

同时，研究者还指出，随着基因编辑技术的发展，病毒工具的应用范围将进一步扩大。例如，病毒可以用于传递CRISPR-Cas9等基因编辑工具，以实现更精确的基因功能研究。然而，这需要病毒载体具备更大的基因容量和更稳定的传播能力。因此，未来的病毒工具开发应结合不同病毒的优势，以实现更广泛的应用。

总之，本研究为植物病毒工具在棉花等非模式植物中的应用提供了重要的参考。尽管TRV在模式植物中表现出良好的功能增强能力，但在棉花中的表现有限，而CLCrV则展现出更强的系统性基因传递能力。因此，在选择病毒工具时，研究者需要根据目标植物的特性进行优化，以确保基因功能研究的效率和准确性。