氧气条件对搅拌式生物反应器中人类间充质基质细胞分泌组产生的影响

《Cytotherapy》：Influence of oxygen conditioning on the production of secretome by human mesenchymal stromal cells in stirred bioreactors

本研究探究了长期缺氧（2% O?）对hWJ-MSCs增殖、代谢及分泌组的影响，发现低氧显著提升细胞密度和代谢活性，但未增加外泌体和蛋白质产量。然而，2% O?条件下的分泌组（包括可溶蛋白和外泌体）显著促进成骨细胞迁移和HUVECs血管生成能力，表明缺氧预处理能优化干细胞分泌物的生物活性，为再生医学提供新策略。

　　本研究聚焦于从人脐带华通氏胶（Wharton’s Jelly）中提取的人类间充质基质细胞（hWJ-MSCs）的分泌物（secretome）在不同氧气浓度下的表现。该分泌物包括多种生物活性成分，如生长因子、细胞因子和细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）。这些成分在再生医学中展现出重要的治疗潜力，例如调节炎症反应、促进组织修复和抑制肿瘤增殖等。然而，传统的2D培养方式在大规模生产方面存在局限性，因此本研究采用了搅拌式Ambr?250生物反应器，结合尺寸排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography, SEC）等技术手段，探索长期低氧条件（7天，氧气浓度分别为2%、10%和19%）对hWJ-MSCs及其分泌物的影响。

研究结果显示，2%氧气浓度条件下，hWJ-MSCs的增殖能力显著增强，细胞密度达到2.5×10? ± 4.2×10?细胞/毫升，远高于10%和19%氧气条件下的2.0×10? ± 2.6×10?细胞/毫升和1.6×10? ± 3.6×10?细胞/毫升。此外，葡萄糖摄取和乳酸生成也明显增加，表明在低氧环境下，细胞代谢活动更为活跃。尽管在2%氧气条件下细胞数量和代谢水平较高，但每细胞产生的颗粒和蛋白质产量却低于高氧环境。这似乎与预期相悖，因为通常认为更高的细胞密度会带来更高的分泌物产量。然而，进一步的实验表明，来源于2%氧气条件的条件培养基（Conditioned Media, CM）和分离的EVs在促进成骨细胞（osteoblasts）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖、迁移以及血管生成能力方面表现更优。这提示我们，虽然低氧条件并未提高分泌物的总产量，但它显著增强了分泌物的生物活性，特别是在细胞迁移和血管生成方面。

在实验设计中，首先在静态培养系统中对hWJ-MSCs进行扩增，以获得足够的细胞数量用于后续的生物反应器培养。之后，将细胞接种在微载体上，并在Ambr?250生物反应器中进行7天的培养。在此期间，细胞在2%氧气条件下表现出更高的增殖速率和细胞密度。为了进一步验证这一现象，研究团队对细胞的代谢活动进行了分析，发现葡萄糖消耗速率和乳酸生成速率在低氧条件下显著上升，这表明细胞在低氧环境下更加活跃地进行糖酵解，以满足其能量需求。值得注意的是，尽管细胞密度和代谢活性提高，但每细胞产生的颗粒和蛋白质数量却有所减少。这一结果提示我们，氧气浓度对分泌物产量的影响可能与细胞增殖、代谢状态及细胞间相互作用等多种因素有关。

为了评估分泌物的生物活性，研究团队对来源于不同氧气条件的CM和EVs进行了功能测试。结果显示，2%氧气条件下的分泌物在促进细胞迁移和血管生成方面表现突出。具体而言，当成骨细胞和HUVECs暴露于2%氧气条件下的CM或EVs时，它们的迁移速度和血管形成能力均显著增强。相比之下，10%和19%氧气条件下的分泌物效果较弱。这一现象可能与低氧环境下某些生物活性分子的浓度变化有关，例如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和表皮生长因子（EGF）等，这些因子在低氧条件下可能被更有效地分泌，从而提升了分泌物的治疗潜力。

此外，研究还探讨了不同氧气浓度对细胞形态和微载体聚集的影响。在2%氧气条件下，细胞在微载体上的附着密度较高，但同时也观察到微载体聚集的现象，这可能与细胞数量过多有关。为了解决这一问题，研究团队在细胞指数增长阶段增加了新的微载体，并调整了搅拌速率，以维持细胞的悬浮状态并防止过度聚集。这些调整表明，在动态培养过程中，细胞行为不仅受到氧气浓度的影响，还与培养系统的物理条件密切相关。

本研究的另一项重要内容是对分泌物的定量分析。通过尺寸排阻色谱法（SEC）对CM和EVs进行了分离，并利用纳米粒子追踪分析（NTA）和BCA蛋白浓度测定方法评估了其粒径和蛋白含量。结果显示，无论氧气浓度如何变化，分泌物的粒径分布均保持相似，且平均粒径在100至150纳米之间。然而，颗粒浓度和蛋白产量在2%氧气条件下略低，这可能与细胞在低氧环境下更倾向于维持细胞活力而非大量分泌相关物质有关。尽管如此，研究团队通过功能测试发现，低氧条件下的分泌物在细胞迁移和血管生成方面表现出更强的生物活性，这为未来优化细胞分泌物的生产条件提供了新的思路。

研究团队还对分泌物的生物活性进行了深入分析，包括其对细胞迁移和血管生成的促进作用。通过伤口愈合实验（wound healing assay）和管形成实验（tube formation assay），研究发现2%氧气条件下的分泌物在促进细胞迁移和血管生成方面效果显著。例如，在伤口愈合实验中，与对照组相比，2%氧气条件下的分泌物能够使细胞迁移速度提升10-20%，而10%和19%氧气条件下的分泌物效果则相对较弱。这一结果进一步验证了低氧条件对分泌物功能的增强作用，可能与低氧环境下某些关键生物分子的表达上调有关，如VEGF、HIF-1α和血管生成素等。

此外，研究还探讨了氧气浓度对细胞存活率和功能的影响。结果显示，2%氧气条件下的分泌物在维持细胞存活率方面表现出更强的潜力。在实验中，使用2%氧气条件下的EVs处理后，细胞存活率可达81.5%±4.3%，而对照组仅为73.5%±4.5%。这一发现表明，低氧条件不仅促进了细胞的增殖和迁移，还有助于细胞的长期存活，从而增强了分泌物的治疗效果。

综上所述，本研究揭示了低氧条件对hWJ-MSCs及其分泌物的重要影响。尽管低氧环境下细胞的总分泌物产量较低，但其生物活性显著增强，特别是在细胞迁移和血管生成方面。这一发现为优化细胞培养条件、提高分泌物的治疗效果提供了重要的科学依据。同时，研究也指出，未来需要进一步探索分泌物的具体分子组成和作用机制，以更好地理解低氧条件如何调控细胞的分泌功能。此外，研究还强调了在动态培养系统中，细胞行为不仅受到氧气浓度的影响，还与培养系统的物理参数密切相关，如搅拌速率、微载体类型和培养时间等。这些因素的综合调控对于实现高效、高质量的分泌物生产至关重要。

本研究的局限性在于，未对分泌物的具体分子组成进行详细分析，因此未来需要结合转录组学、蛋白质组学和脂质组学等多组学方法，进一步揭示低氧条件下分泌物的分子特征及其功能机制。此外，目前的分泌物产量尚未达到临床应用所需的水平，但所使用的生物反应器设计具有良好的可扩展性，为未来的大规模生产提供了基础。这些发现不仅有助于优化hWJ-MSCs的培养条件，还为开发基于分泌物的新型细胞治疗策略提供了理论支持和实验依据。