基于qPCR的快速即时检测方法在检测淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）和β-内酰胺酶（β-lactamase）方面的评估，以指导抗生素的使用

《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Evaluation of rapid point-of-care test based on qPCR for detecting Neisseria gonorrhoeae and β-lactamase to guide the use of antibiotics

基于多重qPCR技术建立淋病奈瑟菌及β-内酰胺酶联合快速检测平台，优化样本处理和扩增流程，实现30分钟内完成检测，灵敏度达1000拷贝/毫升，与培养法及硝普红试验结果高度一致，提升临床诊断效率。

　　本研究旨在建立一种即时检测（point-of-care testing, POCT）方法，用于快速检测淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae, NG）并评估其对β-内酰胺类抗生素的敏感性，从而提升淋病感染的诊断与治疗效率。淋病是一种全球范围内常见的性传播疾病（sexually transmitted disease, STD），由淋病奈瑟菌引起，位居第二。该病菌可以导致男性尿道炎、女性宫颈炎或尿道炎，还可能感染眼睛、咽喉、直肠及盆腔区域，并在某些情况下引发扩散性感染，如关节炎、盆腔炎、败血症、心内膜炎或脑膜炎。若未及时治疗，上行感染可能引发严重的并发症，如盆腔炎、慢性盆腔疼痛、异位妊娠及不孕症。根据世界卫生组织（WHO）的报告，每年全球约有7800万至8700万例新发淋病病例。在2016年，15至49岁人群中，男性淋病感染的患病率约为0.7%，女性约为0.9%。在中国，国家疾病预防控制中心的数据显示，每年约有11.5万例新发淋病病例，2019年的统计显示全国病例约为12万例。然而，与许多发达国家相比，中国淋病感染的发病率仍然较低，这可能反映了诊断能力的不足和病例的漏报，而非真正的流行病学差异。

目前，淋病的治疗主要依赖于抗生素，如头孢曲松单药治疗或与阿奇霉素联合使用。然而，β-内酰胺类抗生素如青霉素、氨苄西林和头孢西丁的耐药性问题日益严重，成为全球防控的重要挑战。这些耐药性通常由质粒编码的TEM β-内酰胺酶介导，检测该基因可以预测β-内酰胺类抗生素的敏感性，并为重新使用曾经有效的抗生素提供潜在可能性。然而，目前尚无针对淋病奈瑟菌和TEM β-内酰胺酶基因联合检测的系统研究。

传统的培养方法是淋病奈瑟菌诊断的标准方法，但其检测周期较长，通常需要2至3天甚至更久，因此在快速和准确的临床诊断方面存在局限。此外，培养方法在操作简便性和敏感性方面也难以满足现代医学对即时诊断的需求。因此，迫切需要一种能够快速检测并指导抗菌治疗的方法。核酸扩增检测（nucleic acid amplification tests, NAATs）因其高灵敏度和特异性，已被广泛应用于病原体检测，其中大多数检测基于实时荧光定量PCR技术。本研究在这一基础上，进一步优化检测流程，建立了一种适用于临床快速诊断的POCT平台。

在本研究中，采用磁珠法对样本进行核酸提取，将提取时间缩短至5分钟，并在样本运输过程中实现核酸的释放与结合。通过特殊试剂的配方，显著降低PCR系统的粘度，使PCR反应在控制温度条件下进行，从而提高引物、探针与模板的杂交效率。最终，将整个检测过程的时间缩短至仅需25分钟，使得整个检测周期从样本处理到结果报告仅需30分钟。这一快速检测方法为临床提供了高效、便捷的诊断手段，有助于及时采取个体化的治疗策略。

为了确保检测的准确性，研究团队设计了针对淋病奈瑟菌LST基因、TEM β-内酰胺酶基因以及人类β-肌动蛋白基因（ACTB）的特异性引物和探针。LST基因在淋病奈瑟菌TUM19854菌株的基因组中被注释为编码N-乙酰半乳糖胺α-2,3-唾液酸转移酶，该酶负责细菌脂多糖（LOS）的唾液酸化，这一过程与淋病感染的增强致病性和免疫逃逸密切相关。人类β-肌动蛋白基因则被用作内参基因，以标准化检测结果并监控实验过程。通过这些优化，研究团队建立了一种能够同时检测LST基因、TEM β-内酰胺酶基因和人类ACTB基因的多重qPCR检测平台，为临床提供了快速诊断的手段。

在临床样本的收集方面，研究团队在2019年1月至12月期间，从深圳中西医结合医院收集了共计922份分泌物样本（其中854份为淋病奈瑟菌阴性样本，68份为阳性样本）以及63份淋病奈瑟菌分离株。通过与传统培养方法的比较，LST基因检测的阳性一致率达到了100%，阴性一致率为98.59%，总体一致率为98.70%。这表明LST基因检测在临床应用中具有高度的准确性和可靠性。此外，对于携带TEM β-内酰胺酶基因的淋病奈瑟菌分离株，总体患病率为68.25%，其中86.05%的PPNG分离株携带TEM β-内酰胺酶基因。与硝唑西林试验相比，TEM β-内酰胺酶基因检测的阳性一致率为86.05%，阴性一致率为75.00%，总体一致率为82.54%。这表明TEM β-内酰胺酶基因检测在临床应用中也具有较高的准确性和可靠性。

本研究建立的POCT平台不仅能够快速检测淋病奈瑟菌，还能评估其对β-内酰胺类抗生素的敏感性，从而为临床提供即时诊断和个体化治疗的依据。这一平台在提高诊断效率的同时，也便于及时采取适当的治疗措施，减少疾病传播的风险。此外，该平台的建立为未来进一步优化检测流程和提升检测能力提供了新的思路和方向。

在讨论部分，研究团队指出，由于淋病奈瑟菌的高传播性和潜在的耐药性问题，快速诊断和治疗指导显得尤为重要。本研究开发的实时PCR检测系统在检测淋病奈瑟菌及其β-内酰胺酶基因方面表现出良好的性能，具有成为POCT平台的潜力。该平台的快速检测能力使得医生能够在短时间内获得诊断结果，从而及时制定治疗方案。此外，该平台的建立也为未来的临床研究提供了基础，有助于进一步探索淋病感染的分子机制和治疗策略。

本研究的成果不仅在临床应用中具有重要意义，也为科研领域提供了新的方向。通过优化检测流程和提高检测效率，研究团队成功建立了快速、准确的检测平台，为临床诊断和治疗提供了有力支持。此外，该平台的建立还为未来的临床研究提供了基础，有助于进一步探索淋病感染的分子机制和治疗策略。研究团队还提到，该平台的开发为未来进一步优化检测流程和提升检测能力提供了新的思路和方向，同时也为提高公众健康水平和减少疾病传播风险提供了新的手段。

在资金支持方面，本研究得到了宝安区科技创新局基金（项目编号：2019JD224）以及广东省基础与应用基础研究基金（项目编号：2023A1515220253）的支持。研究团队感谢宝安区科技创新委员会和广东省基础与应用基础研究基金委员会对本研究的资助。这些资金支持为研究的顺利进行提供了保障，使得研究团队能够专注于检测方法的优化和平台的建立。

在伦理审批方面，所有患者样本均获得了深圳中西医结合医院的知情同意，并得到了医院伦理委员会的批准。这一伦理审批确保了研究的合法性，同时也保障了患者的权益。研究团队在样本收集和处理过程中严格遵守伦理规范，确保了研究的科学性和伦理性。

在作者贡献声明中，研究团队成员分别承担了不同的任务。Shue Zhu负责概念设计和方法开发；Xuanmei Huang负责撰写初稿和修改；Wenqing Lai负责验证；Yue He负责调查；Yixuan Liu负责数据分析；Rui Chen负责监督；Helu Liu负责资金获取和项目管理。这些分工确保了研究的顺利进行，并为最终成果的产出提供了保障。

总体而言，本研究建立了一种快速、准确的分子诊断方法，为淋病奈瑟菌的检测和β-内酰胺类抗生素的敏感性评估提供了新的手段。这一平台的建立不仅提高了诊断效率，还为及时采取适当的治疗措施提供了支持，有助于减少疾病传播的风险和提升公众健康水平。此外，该平台的开发为未来的临床研究提供了基础，有助于进一步探索淋病感染的分子机制和治疗策略。研究团队的努力和贡献为这一领域的发展提供了重要支持，并为未来的科研和临床应用提供了新的方向。