《European Journal of Medicinal Chemistry》：Inhibitors of membrane associated serine proteases block replication of coronavirus SARS-CoV-2 and influenza virus H1N1
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本研究通过基于酶底物特异性的PS-SCL筛选，开发了新型α-酮苯并噻唑（kbt）共价抑制剂，优化了三肽抑制剂Ac-QFR-kbt的选择性，发现四肽化合物Bz-QFR-kbt和Cbz-QFR-kbt对SARS-CoV-2和H1N1流感病毒抑制效果显著，并验证了其药代动力学特性。
维多利亚·巴纳斯（Victoria Banas）|库尔吉特·西赫拉（Kuljeet Seehra）|马修·马奥尼（Matthew Mahoney）|卡罗莱纳·阿利西奥（Carolina Alisio）|叶夫根尼·基留卡（Yevhenii Kyriukha）|伊丽莎白·韦兰德（Elizabeth Weiland）|米歇尔·法斯（Michelle Fath）|韩振福（Zhenfu Han）|特蕾西·布里克（Traci Bricker）|迈克尔·塔特尔（Michael Tartell）|肖恩·惠兰（Sean Whelan）|阿德里亚努斯·C.M. 布恩（Adrianus C.M. Boon）|詹姆斯·W. 珍特卡（James W. Janetka）
美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院生物化学与分子生物物理学系，邮编63110
摘要
TMPRSS2是一种与膜相关的丝氨酸蛋白酶，在冠状病毒和流感病毒的致病过程中起着重要作用。我们利用TMPRSS2的底物特异性PS-SCL筛选方法，设计了基于机制的共价α-酮苯并噻唑（kbt）抑制剂。合成了三种不同的四肽kbt库，并评估了它们对TMPRSS2、基质裂解酶（matriptase）及其他丝氨酸蛋白酶的抑制效果。我们还研究了之前报道的三肽抑制剂Ac-QFR-kbt（18）的不同封端基团，以提高其对血液凝固蛋白酶因子Xa的选择性。最有效的化合物被用于检测其对SARS-CoV-2冠状病毒和H1N1流感A病毒的抑制能力，并对其在小鼠体内的药代动力学（PK）进行了研究。结果发现了几种具有改进效价、选择性和药物特性的新化合物，包括Bz-QFR-kbt（23）和Cbz-QFR-kbt（25），其IC50分别为150 nM和60 nM（针对H1N1）。
引言
TMPRSS2是一种跨膜丝氨酸蛋白酶，参与癌症的发病机制，以及冠状病毒和流感病毒的感染过程。由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的COVID-19大流行，对全球公众和科学界都是一次深刻的启示。这场疫情影响了人类生活的方方面面，并凸显了未来可能出现的由其他病毒或细菌引发的疫情威胁，因为现有的药物可能对这些新病毒无效。令人难以置信的是，针对这种病毒的疫苗和多种新候选药物以前所未有的速度被研发出来。这得益于全球科学家的共同努力，他们揭示了该病毒的组成及其致病机制。这项工作发现了几种潜在的治疗靶点，其中最重要的是TMPRSS21。
TMPRSS2在SARS-CoV-23感染以及其他冠状病毒和流感病毒感染中的作用在于切割RNA病毒的外层糖蛋白Spike和血凝素A（HA）。Spike和HA蛋白需要部分蛋白水解4才能与宿主细胞受体（如SARS-CoV-2中的ACE2）结合5。TMPRSS2位于肺上皮细胞表面，这些病毒利用其这一特性来执行病毒与宿主细胞的结合及进入呼吸道上皮细胞的过程。我们和其他研究也证明，使用小分子抑制剂抑制TMPRSS2可以减少病毒复制8，这表明TMPRSS2是开发广谱抗病毒药物的潜在靶点。此外，TMPRSS2、肝素酶（hepsin）和基质裂解酶（matriptase）在癌症中也起着重要作用9，相关抑制剂已显示出抗癌效果10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18。
TMPRSS2和基质裂解酶都属于II型跨膜丝氨酸蛋白酶（TTSP）19家族，属于与膜相关的丝氨酸蛋白酶（MASPs）4。除了SARS-CoV-2外，TMPRSS2还被证实与其他冠状病毒感染相关20，包括SARS-CoV21、MERS23、24、25。此外，TMPRSS226、27、28、29以及其他TTSPs19（包括基质裂解酶31、32和TMPRSS11D/HAT（人呼吸道类胰蛋白酶）27、33）已被证明可以通过溶酶体途径切割流感A病毒的HA蛋白34, 35，从而帮助病毒进入细胞。还有报道称TMPRSS436、37、38和TMPRSS1339、40、41也参与了冠状病毒和流感病毒的细胞侵入和致病过程。已经开发出多种基质裂解酶抑制剂，这些抑制剂对流感病毒具有抑制作用42, 43, 44。
我们之前报道了TPRSS2的肽基α-酮苯并噻唑（kbt）共价可逆抑制剂6的研制，并证明它们在体外和体内对SARS-CoV-2感染具有显著的抗病毒效果6, 8。其他研究也报道了类似的抑制剂7, 42, 45，以及非肽类抑制剂43。在这里，我们继续基于TMPRSS2的底物特异性（通过组合底物库PS-SCL筛选获得），开发这类抑制剂的构效关系（SAR）并优化初始先导化合物。
抑制剂的设计与合成
我们之前发现的TMPRSS2四肽kbt抑制剂Ac-IQFR-kbt（1）、Ac-GQFR-kbt（2）和Ac-PQFR-kbt（3）对TMPRSS2的抑制作用非常强（表1）。PS-SCL研究9显示，TMPRSS2四肽底物的侧链偏好顺序为：P4位置的异亮氨酸（I）、P3位置的谷氨酰胺（Q）和P2位置的苯丙氨酸（F），这是基于侧链切割率的定量排序得出的。
结论
我们显著改进了之前报道的TMPRSS2和基质裂解酶抑制剂，这些抑制剂能够有效抑制SARS-CoV-2冠状病毒和H1N1流感病毒的复制。这证明了从单一化合物出发开发广谱抗病毒药物的可能性，因为这些抑制剂同时针对TMPRSS2和基质裂解酶——这两种蛋白酶是病毒糖蛋白Spike和HA的主要蛋白水解酶，对所有冠状病毒和流感A病毒的宿主细胞侵入和复制至关重要。我们鉴定出了25种和23种有效的抑制剂。
实验方法
基质裂解酶蛋白结构域的表达与纯化。人类基质裂解酶的催化结构域按照已有文献的方法进行纯化50, 51>，并进行了一些修改。具体步骤如下：从IDT（爱荷华州科拉维尔）购买编码序列596至855片段的DNA片段，通过PCR扩增后克隆到pET28a载体中，并在NdeI/XhoI限制性酶切位点添加N端His6标签。DNA序列通过Genewiz公司进行测序验证。
作者贡献声明
韩振福（Zhenfu Han）：数据可视化、验证、资源提供、方法学设计、实验实施。米歇尔·法斯（Michelle Fath）：数据可视化、验证、资源提供、方法学设计、实验实施。伊丽莎白·韦兰德（Elizabeth Weiland）：数据可视化、验证、资源提供、方法学设计、实验实施。阿德里亚努斯·布恩（Adrianus Boon）：论文撰写与修订、初稿撰写、数据可视化、实验监督、资源协调、方法学设计、数据分析、概念构建。维多利亚·巴纳斯（Victoria Banas）：数据可视化、验证、资源提供。
