通过优化吩嗪衍生物，实现第二代吩噻嗪类抗精神病药物作为抗真菌先导分子的再利用

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Second generation repurposing of phenothiazine antipsychotic drugs as antifungal lead molecules via optimization of phenoxazine derivatives

抗真菌药物开发：基于苯氧嗪（POZ）的氟哌啶醇类似物优化及其药效评估

　　近年来，真菌感染已成为全球范围内日益严重的公共卫生问题。每年报告的病例数以百万计，这不仅威胁着普通人群的健康，还对免疫系统受损的患者，如HIV感染者或正在接受免疫抑制剂治疗的个体，构成更大的风险。尽管真菌感染的发病率较高，但在过去50年里，针对这类疾病的药物开发却进展缓慢。目前，用于治疗侵袭性真菌感染（IFIs）的主要药物类别仅有三种：自20世纪50年代引入的两性霉素B、20世纪70年代开发的咪唑类药物，以及2002年获批的棘白菌素类药物。然而，即使这些药物在临床中广泛应用，它们对某些真菌感染的治疗效果仍不尽人意，尤其是在治疗侵袭性念珠菌病和隐球菌性脑膜炎时，全球死亡率仍然居高不下，分别达到20-50%和41-61%。此外，随着抗真菌药物耐药性的不断上升，特别是像耐药性念珠菌属Auris（C. auris）等“全耐药”菌株的出现，真菌感染的预后可能进一步恶化。因此，开发新的抗真菌药物类别被认为是当前感染性疾病领域最紧迫的未满足临床需求之一。

隐球菌性脑膜炎（Cryptococcal Meningitis, CM）是一种由隐球菌属（Cryptococcus neoformans）引起的致命性感染。目前，治疗CM的主要方案依赖于氟康唑、两性霉素B（AMB）或5-氟胞嘧啶（5FC）的联合使用。然而，这些治疗方案在许多高发隐球菌性脑膜炎的地区仍难以获得。例如，在资源有限的国家，AMB-5FC治疗方案由于需要在医院环境中进行静脉注射，且成本较高，因此对大多数患者来说并不易得。此外，AMB具有明显的不良反应，而5FC则可能导致骨髓毒性。尽管隐球菌性脑膜炎是目前最常见的真菌中枢神经系统（CNS）感染，但几乎所有人类真菌病原体都有能力引起CNS感染，且其后果通常比影响其他器官的感染更为严重。

在开发针对隐球菌性脑膜炎和其他侵袭性真菌感染的新药物时，一个主要的挑战是如何克服血脑屏障（BBB）。因此，利用苯并噻嗪（PTZ）类抗精神病药物的抗真菌活性成为一种有前景的策略，因为这类药物能够较为容易地穿过BBB。早在多年前，人们就已经认识到PTZ类药物的抗真菌活性，但其抗真菌作用一直未被充分优化。它们通常被称为“多功能药物”，因为它们对多种神经受体具有药理学影响。在我们之前的研究中，发现由PTZ衍生的抗精神病药物，如氟哌啶醇，可以作为开发新型抗真菌化合物的有潜力的起点。例如，氟哌啶醇对隐球菌属（C. neoformans）的最小抑菌浓度（MIC）为8 μg/mL。然而，其对多巴胺和血清素受体的亲和力促使我们进一步优化该化合物，以寻找更具选择性的类似物。通过结构-活性关系（SAR）研究，我们开发出了一个改良的氟哌啶醇类似物（CWHM-974），该化合物在抗真菌活性方面有所提升，其MIC为4 μg/mL，同时由于在连接链中插入了苯基环，对神经受体的亲和力有所降低（图1）。此外，CWHM-974中的PTZ头部基团含有一个硫原子，该硫原子在体内容易被代谢氧化为亚砜，而氧化后的产物则表现出较差的抗真菌活性和较低的溶解度。最近的研究表明，苯并恶嗪（POZs）可以作为替代的头部基团，仅造成约2倍的活性损失。尽管已有大量文献探讨PTZ类药物的抗真菌特性，但针对POZs的研究仍然较为有限，且目前报道的PTZ类抗精神病药物的POZ类似物并未涉及抗真菌活性或选择性的研究。

本研究旨在合成一系列POZ类似物，并对其进行全面的结构-活性关系（SAR）研究，系统地探讨头部基团、连接链和尾部基团对药物活性的影响。通过这些研究，我们识别出新的POZ化合物，作为治疗隐球菌性脑膜炎和其他侵袭性真菌感染的潜在候选药物。我们设计并合成了一系列POZ类似物，通过优化其结构，提高了对隐球菌属（C. neoformans）和白色念珠菌（C. albicans）的抗真菌活性。其中，某些POZ类似物表现出较强的抗真菌活性，同时对神经受体具有较低的亲和力，这使得它们在治疗过程中具有更高的安全性和选择性。然而，在隐球菌性脑膜炎的小鼠模型中，某些具有较强抗真菌活性且具有一定选择性的POZ类似物（编号61）未能展现出显著的治疗效果，这表明需要进一步优化这些化合物，以提高其在体内的生物活性和治疗效果。

在本研究中，我们通过合成一系列POZ类似物，并结合详细的结构-活性关系研究，探索了不同结构对药物活性的影响。我们发现，通过调整头部基团、连接链和尾部基团的结构，可以显著增强POZ类似物的抗真菌活性，同时减少其对神经受体的亲和力。这不仅有助于提高药物在体内的疗效，还能够降低其在治疗过程中可能带来的副作用。通过这些优化，我们得到了一些新的POZ化合物，它们在体外实验中对隐球菌属和白色念珠菌表现出显著的抗真菌活性，其最小抑菌浓度分别为1-4 μg/mL和2-8 μg/mL，分别比氟哌啶醇和三氟哌啶醇强4-16倍。这些结果表明，通过结构优化，POZ类药物在抗真菌治疗中具有广阔的应用前景。

在合成过程中，我们采用了一种合成路线（如图1A所示），通过将2-溴酚（1a-r）与氟硝基苯（2a-r）反应，得到了2-溴苯氧基苯胺（3a-3r），产率良好（总产率为49-80%）。随后，通过钯催化的苯并恶嗪化反应（Buchwald-Hartwig coupling），我们进一步合成了POZ类似物。然而，该反应的转化率较低，产率也相对有限。为了提高合成效率和产率，我们对反应条件进行了优化，并对合成路径进行了改进。通过这些改进，我们成功合成了多种POZ类似物，并对其进行了系统的结构-活性关系研究。这些研究不仅揭示了不同结构对药物活性的影响，还帮助我们筛选出具有更强抗真菌活性和更优选择性的化合物。

为了评估这些POZ类似物的抗真菌活性，我们进行了详细的体外实验。实验结果显示，这些化合物对隐球菌属和白色念珠菌均表现出显著的抑制作用。其中，某些化合物的最小抑菌浓度远低于现有药物，显示出更强的抗菌活性。此外，我们还对这些化合物的神经受体亲和力进行了评估，发现其对血清素和多巴胺受体的亲和力明显低于三氟哌啶醇。这一结果表明，通过结构优化，我们能够减少药物对神经系统的副作用，同时保持其对真菌的有效作用。然而，在某些情况下，药物的抗真菌活性虽然较强，但其在体内治疗效果仍不理想，这可能是由于药物在体内的代谢、分布或渗透性等方面存在问题。因此，我们需要进一步研究这些化合物的药代动力学特性，以确保其在体内的有效性。

除了体外实验，我们还进行了动物实验，以评估这些POZ类似物在体内的治疗效果。实验结果表明，尽管某些化合物在体外表现出较强的抗真菌活性，但在隐球菌性脑膜炎的小鼠模型中，其治疗效果仍不理想。这可能是由于药物在体内无法有效穿过血脑屏障，或者其在体内代谢过程中活性下降。因此，我们需要进一步优化这些化合物，以提高其在体内的生物利用度和治疗效果。此外，我们还对这些化合物的毒性和安全性进行了评估，发现它们在体外实验中表现出较低的毒性，这表明它们在体内治疗过程中可能具有较好的安全性。然而，进一步的体内研究仍然是必要的，以全面评估这些化合物的临床潜力。

在本研究中，我们还对合成的化合物进行了详细的分析，以确保其纯度和结构的正确性。所有最终合成的化合物均通过高效液相色谱（HPLC）检测，其纯度均高于95%。此外，我们还通过高分辨率质谱（HRMS）和核磁共振（NMR）技术对化合物的结构进行了确认。这些分析结果表明，合成的POZ类似物具有明确的化学结构，并且其纯度和结构的正确性得到了保障。这为后续的体外和体内实验提供了可靠的物质基础。

在抗真菌活性测试中，我们采用了一种标准化的方法，即根据CLSI指南进行最小抑菌浓度（MIC）测定。实验结果显示，这些POZ类似物对隐球菌属和白色念珠菌均表现出良好的抗真菌活性。其中，某些化合物的MIC显著低于现有药物，显示出更强的抗菌效果。此外，我们还对这些化合物的神经受体亲和力进行了评估，发现其对血清素和多巴胺受体的亲和力明显低于三氟哌啶醇。这一结果表明，通过结构优化，我们能够减少药物对神经系统的副作用，同时保持其对真菌的有效作用。然而，在某些情况下，药物的抗真菌活性虽然较强，但其在体内治疗效果仍不理想，这可能是由于药物在体内无法有效穿过血脑屏障，或者其在体内代谢过程中活性下降。因此，我们需要进一步优化这些化合物，以提高其在体内的生物利用度和治疗效果。

在本研究中，我们还对合成的POZ类似物进行了详细的分析，以确保其纯度和结构的正确性。所有最终合成的化合物均通过高效液相色谱（HPLC）检测，其纯度均高于95%。此外，我们还通过高分辨率质谱（HRMS）和核磁共振（NMR）技术对化合物的结构进行了确认。这些分析结果表明，合成的POZ类似物具有明确的化学结构，并且其纯度和结构的正确性得到了保障。这为后续的体外和体内实验提供了可靠的物质基础。

在本研究中，我们还对POZ类似物的神经受体亲和力进行了评估。通过使用国家精神卫生研究所（NIMH）的致幻药物筛选计划，我们对这些化合物的血清素和多巴胺受体结合能力进行了测定。实验结果显示，这些POZ类似物对神经受体的亲和力显著低于三氟哌啶醇，这表明它们在治疗过程中可能具有更好的安全性。然而，进一步的体内研究仍然是必要的，以全面评估这些化合物的临床潜力。

此外，我们还对POZ类似物的药代动力学特性进行了初步研究。实验结果显示，这些化合物在体内的分布和代谢特性与现有药物有所不同，这可能影响其在体内的疗效。因此，我们需要进一步研究这些化合物的药代动力学特性，以优化其在体内的治疗效果。通过这些研究，我们希望能够找到一种既能有效抑制真菌感染，又能够减少对神经系统的副作用的药物。

总的来说，本研究通过结构优化，开发了一系列具有较强抗真菌活性的POZ类似物。这些化合物在体外实验中表现出良好的抗菌效果，同时对神经受体的亲和力较低，显示出更好的安全性。然而，在体内治疗效果方面，仍需进一步研究和优化，以确保其在临床中的应用潜力。通过这些研究，我们希望能够为抗真菌药物的开发提供新的思路和方向，同时也为治疗隐球菌性脑膜炎和其他侵袭性真菌感染提供新的药物候选。