二甲双胍通过抑制Nr4a1/Wnt/β-连环蛋白信号通路，阻止小鼠跟腱的异位骨化

《Evolving Earth》：Metformin inhibits heterotopic ossification of mouse Achilles tendon by inhibiting the Nr4a1/Wnt/β-catenin signaling pathway

异位骨化小鼠模型中，甲酸肼通过抑制干细胞成骨分化，下调核受体亚家族4A1（Nr4a1）表达，阻断Wnt/β-catenin信号通路，显著减少异位骨体积及成骨标志物表达。

　　异位骨化（Heterotopic Ossification, HO）是一种病理过程，其特点是软组织中异常形成骨组织，如肌腱、肌肉和韧带等，导致关节疼痛、僵硬、功能障碍以及生活质量下降。这种现象在创伤、手术或慢性炎症后尤为常见，其发生机制复杂，涉及多种细胞信号通路和分子机制。由于手术切除仍是目前治疗异位骨化的首选方法，但其高复发率和缺乏有效的非手术干预手段，因此深入研究异位骨化的分子机制对于开发更安全、有效的治疗策略至关重要。

近年来，研究发现异位骨化与细胞分化异常密切相关，尤其是肌腱来源的间充质干细胞（Tendon-derived Stem Cells, TDSCs）在异位骨化过程中的作用日益受到关注。TDSCs具有多向分化潜能，包括成骨、成脂和成软骨等，而它们在异常条件下可能被激活，导致骨组织在非骨骼部位的形成。因此，探索如何调控这些干细胞的分化方向，成为预防和治疗异位骨化的潜在策略。在此背景下，研究人员对二甲双胍（Metformin）的潜在作用进行了深入研究，发现其在抑制异位骨化方面具有显著效果。

二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线药物，具有多种生物学效应，包括抗炎、抗氧化以及调节细胞分化的功能。这些特性使其在非糖尿病人群中也展现出治疗潜力。研究发现，二甲双胍在骨代谢中能够通过抑制成骨细胞的过度激活和炎症反应，减轻骨质疏松和骨折模型中的骨丢失。此外，在异位骨化的动物模型中，二甲双胍通过激活AMPK信号通路，抑制NF-κB信号通路，从而减轻早期炎症反应，调节巨噬细胞极化，并减少促成骨因子的释放。这些作用机制表明，二甲双胍可能通过多种途径抑制异位骨化的发生。

在本研究中，科学家采用了一种经过验证的肌腱截断和背烧伤模型，以诱导异位骨化。通过在小鼠模型中给予二甲双胍治疗，观察到其显著减少了异位骨化的发生和严重程度。实验结果显示，二甲双胍能够有效降低异位骨体积，并减少成骨相关基因的表达。这些结果与之前的研究一致，表明二甲双胍在异位骨化中的抑制作用具有潜在的临床意义。

为了进一步揭示二甲双胍的作用机制，研究人员通过体外实验分析了其对TDSCs成骨分化的影响。实验发现，二甲双胍能够以剂量依赖性方式抑制TDSCs的成骨分化，减少钙结节沉积和成骨标志物的表达。此外，通过转录组分析，研究人员发现二甲双胍治疗的异位骨化样本中，Nr4a1的表达显著下调。进一步的体外实验表明，Nr4a1的激活能够促进TDSCs的成骨分化，而Nr4a1的敲低则显著抑制这一过程。这些结果提示，Nr4a1可能在异位骨化的发生中起到关键作用。

进一步的研究揭示了Nr4a1与Wnt/β-catenin信号通路之间的相互作用。实验表明，二甲双胍能够显著降低Wnt4和β-catenin的表达，而Nr4a1的激活则能够增强这些因子的表达。这表明Nr4a1通过正向调控Wnt/β-catenin信号通路促进异位骨化。因此，二甲双胍可能通过抑制Nr4a1的表达，从而阻断Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制TDSCs的成骨分化，达到预防异位骨化的目的。

为了验证这一假设，研究人员设计了一系列实验，包括使用Csn-B（一种Nr4a1的特异性激动剂）和PNU-74654（一种Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂）进行联合干预。实验结果表明，Csn-B能够逆转二甲双胍对TDSCs成骨分化的抑制作用，而PNU-74654则能够恢复二甲双胍的抑制效果。这进一步支持了二甲双胍通过Nr4a1/Wnt/β-catenin信号通路抑制异位骨化的机制。

此外，研究还发现Nr4a1的激活能够促进异位骨化，而二甲双胍通过抑制Nr4a1的表达，从而降低异位骨化的发生率。这一发现不仅揭示了二甲双胍的分子作用机制，还为异位骨化的治疗提供了新的思路。Nr4a1作为调控TDSCs成骨分化的关键因子，可能成为治疗异位骨化的潜在靶点。

本研究的局限性在于仅使用了雄性C57BL/6小鼠进行体内实验，未能充分考虑性别差异对异位骨化病理过程和治疗反应的影响。已有临床研究表明，男性异位骨化的发生率显著高于女性，这可能与性激素调控有关。雄激素可能促进间充质干细胞的成骨分化，而雌激素则在骨稳态调节中起关键作用，并具有抗炎特性。因此，未来的研究应纳入雌性小鼠，以系统评估性别对异位骨化的影响，以及二甲双胍在不同性别中的治疗效果。

综上所述，本研究揭示了二甲双胍在抑制异位骨化中的作用机制，即通过下调TDSCs中Nr4a1的表达，从而阻断Wnt/β-catenin信号通路，抑制成骨分化。这一发现不仅为异位骨化的治疗提供了新的思路，还为二甲双胍在非糖尿病人群中的应用拓展了可能性。尽管研究结果具有重要的科学价值，但关于二甲双胍如何抑制Nr4a1的具体机制以及Nr4a1与Wnt/β-catenin信号通路之间的直接调控关系仍需进一步研究。此外，缺乏临床样本验证Nr4a1和Wnt/β-catenin在异位骨化中的表达变化，也限制了研究的临床转化潜力。因此，未来的研究应结合临床样本，进一步评估二甲双胍在异位骨化预防和治疗中的实际应用效果。