《Experimental Eye Research》：Mouse Gata1 3’UTR modulates Gata1 levels to affect erythropoiesis
编辑推荐：
Gata1 3’UTR通过调控ELAVL1与AU元件相互作用维持红细胞生成稳定性。利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠Gata1 3’UTR导致基底性贫血和胎儿肝脏红细胞生成缺陷，机制研究显示3’UTR缺失引起Gata1 mRNA不稳定，该过程与ELAVL1解离AU富集元件有关，RNA pulldown结合质谱验证了相互作用，Dihydro-tanshinone-I抑制剂和过表达实验证实ELAVL1对Gata1 mRNA的稳定起关键作用。
凌凌|黄家文|戴志晨|杨兰|杨帆|龚芳瑜|邱新辉|吕梦颖|王芳芳|梁静妍|何胜|于多楠
中国江苏省扬州市扬州市立妇幼保健院（邮编225002）
摘要
mRNA的3’非翻译区（3’UTR）对转录后基因调控至关重要，主要通过miRNA实现。然而，Gata1 3’UTR在哺乳动物中的整体作用仍不明确。在本研究中，我们敲除了Gata1 3’UTR，观察到突变小鼠的红细胞生成出现缺陷，表现为基线时出现巨幼细胞性贫血。Gata1 3’UTR的缺失还导致胎儿肝脏中的红细胞生成受损。从机制上讲，去除Gata1 3’UTR会破坏Gata1 mRNA的稳定性，从而降低GATA1蛋白的水平。这种稳定性的降低是由于3’UTR中的富含AU（腺嘌呤尿苷）的元件与一种名为ELAVL1的转录因子解离所致。具体而言，我们进行了RNA pull-down实验并利用质谱技术鉴定与Gata1 3’UTR结合的蛋白质。基因本体论分析显示，ELAVL1几乎在所有与mRNA稳定性相关的类别中都是Gata1的结合伙伴。Western blotting、RNA免疫沉淀和突变实验均证实了Gata1 3’UTR与ELAVL1之间的直接相互作用。通过使用小分子抑制剂Dihydro-tanshinone-I调节ELAVL1的活性或蛋白水平，或在红系细胞中过表达ELAVL1，验证了ELAVL1作为Gata1 mRNA稳定因子的作用。我们的研究结果强调了Gata1 mRNA 3’UTR在红系细胞发育中的重要作用。
预告摘要：Gata1 3’UTR在哺乳动物中的作用尚不清楚。在本研究中，我们生成了Gata1 3’UTR敲除小鼠，并观察到红细胞生成缺陷，表现为基线时出现巨幼细胞性贫血。从机制上讲，去除Gata1 3’UTR会破坏Gata1 mRNA的稳定性，导致GATA1蛋白表达减少。这种mRNA稳定性的降低是由于3’UTR中的富含AU的元件与转录因子ELAVL1解离所致，而非由于miRNA结合能力丧失或多聚A序列缺失。我们的研究结果突显了Gata1 3’UTR在红系细胞发育中的关键作用。
章节片段
引言
GATA1是一种“主”转录因子，负责调控多种血细胞类型的生成，如红细胞（RBCs）、血小板、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和树突状细胞[[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]]。它在红细胞生成（erythropoiesis）中的作用尤为重要。缺乏Gata1基因的小鼠会患有严重贫血，无法存活超过胚胎发育的9.5至11.5天[[1], [2], [3]]。有趣的是，过量的GATA1表达会导致红细胞生成缺陷。
细胞培养
小鼠红白血病（MEL）细胞在IMDM培养基（Cat# SH30228.01，Hyclone，美国）中培养，添加10%胎牛血清（FBS）。通过DMSO或N,N-己二甲基乙酰胺（HMBA）诱导红细胞成熟。G1E细胞的培养和维持按照[19]中的方法进行。G1E-JC4是一种稳定表达条件性活性GATA-1/雌激素受体（ER）融合蛋白的红细胞前体细胞系。当G1E-JC4细胞接受雌二醇处理时，GATA-1会被激活，从而引发
Gata1 mRNA的3’UTR序列缺失导致红细胞生成过程中出现轻度贫血
尽管小鼠Gata1 mRNA的3’UTR包含miRNA结合位点等功能元件，但Gata1 3’UTR在哺乳动物中的整体功能尚未明确。为了确定小鼠Gata1 3’UTR的作用，我们使用CRISPR/CAS9技术去除了该序列（图1A）。通过尾组织中的基因组DNA进行PCR验证，确认了序列的缺失（补充图S1A、B）。具有缺失序列的小鼠按照孟德尔遗传规律出生
讨论
小鼠成熟红细胞的平均寿命为40天。每秒钟，人体骨髓会产生约250万个功能性红细胞，同时也有相同数量的红细胞死亡。这表明红细胞生成受到精确调控。GATA1是正常红细胞发育的关键转录因子，在正常红细胞生成过程中会发生动态变化，表明其表达水平也受到精确控制。本研究表明，小鼠Gata1 mRNA的3’UTR
缩写
ARE：富含AU的元件
ARE-BP：富含AU的RNA结合蛋白
BM：骨髓
CBC：全血细胞计数
CDS：编码序列
CMP：共同髓系祖细胞
DEG：差异表达基因
DHTS：二氢丹参酮-I
ELAVL1：ELAV样家族1
FL：胎儿肝脏
FSC：前向散射通道
GEO：基因表达组学数据库
GO：基因本体论
GSEA：基因集富集分析
Hb：血红蛋白
HNRNPD
：异质核糖核蛋白DHSP70：热休克蛋白70
KO：敲除
MCHC
数据和材料的获取
与本研究相关的数据可向通讯作者（D.Y.）索取。数据集可通过NCBI-GEO仓库GSE279985获取。伦理审批和参与同意
该动物研究获得了扬州大学研究伦理委员会、四川省人民医院以及中国电子科技大学的批准。
