在慢性肾病的高磷血症条件下，LincRNA-p21通过小细胞外囊泡促进血管平滑肌细胞的凋亡和钙化

《Evolving Earth》：LincRNA-p21 drives apoptosis and calcification of vascular smooth muscle cell via small extracellular vesicles under hyperphosphatemic conditions in chronic kidney disease

磷酸诱导小鼠主动脉平滑肌细胞（MASMC）钙化机制研究：发现lincRNA-p21通过调控小型外泌体分泌介导细胞凋亡及骨形成标志物（BGP、OCN、OPN）表达变化，其过表达加剧钙化，抑制则缓解。揭示外泌体作为信号载体在磷致血管钙化中的关键作用。

　　

Jianbing Hao|Siyu Wang|Lirong Hao

中国深圳市南方科技大学医院肾病科

摘要

血管钙化是心血管疾病的主要诱因之一，它在慢性肾脏病（CKD）的高磷血症条件下导致血管平滑肌细胞（VSMC）发生病理性成骨转化。本研究探讨了lincRNA-p21和小胞外囊泡在磷酸盐诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞（MASMC）钙化中的作用。暴露于2.6 mmol/L的磷酸盐会引发时间依赖性的钙化过程，表现为钙沉积增加、内质网重塑以及细胞内钙积累（与24/48小时对照组相比，p<0.05）。同时，成骨相关标记物（BGP、OCN和OPN）和lincRNA-p21的表达显著上调，而收缩型表型特异性标记物（SM22α、SM-MHC和SM α-actin）的表达则显著下调。这种基因表达模式与MASMC的成骨转化过程相关。从磷酸盐处理过的MASMC中分离出的小胞外囊泡含有高水平的lincRNA-p21（p<0.05），并能诱导受体细胞的钙化和凋亡，表明小胞外囊泡可能介导钙化信号的传递。功能研究表明，lincRNA-p21的过表达会加剧钙化、凋亡和成骨相关标记物的表达，而其敲低则能减轻这些效应（p<0.05）。时间进程分析显示，lincRNA-p21动态调节小胞外囊泡的分泌、钙积累和凋亡途径，起到驱动磷酸盐诱导钙化的分子开关作用。这些发现表明lincRNA-p21通过小胞外囊泡依赖的机制在MASMC钙化中起关键作用，为血管钙化的治疗策略提供了新的见解。

引言

血管钙化是一种以血管内磷酸钙沉积为特征的病理过程，会加重动脉僵硬并增加心血管疾病的风险，尤其是在慢性肾脏病（CKD）患者中。最新研究表明，长链非编码RNA（lincRNA）是心血管病理生理学的重要调节因子。其中，lincRNA-p21通过多种机制调节血管稳态，成为关键的分子调控因子[1]、[2]。

作为一条长的基因间非编码RNA，lincRNA-p21通过转录和转录后机制在心血管疾病（CVDs）中发挥多效作用[3]、[4]。在心脏肥厚和心力衰竭中，lincRNA-p21直接激活NFAT（活化T细胞的核因子）和MEF2（肌细胞增强因子2）信号通路，这些通路对心肌应激反应至关重要[5]。这种激活会促进异常的心肌细胞增殖和肥大，最终损害心脏功能。值得注意的是，实验性抑制lincRNA-p21可以减轻压力超负荷引起的心脏肥大[5]。在动脉粥样硬化中，lincRNA-p21调控miR-221/SIRT1/Pcsk9信号轴[6]，调节胆固醇代谢和血管平滑肌细胞（VSMC）的动态[7]，并通过增强p53活性抑制VSMC增殖并促进凋亡，从而延缓动脉粥样硬化斑块的进展[8]、[9]。

在心肌缺血/再灌注损伤过程中，lincRNA-p21通过靶向miR-466i-5p上调Nr4a2（核受体亚家族4A组成员2）[10]，加剧细胞损伤，放大凋亡和炎症反应。此外，lincRNA-p21通过驱动VSMC表型转换促进氧化应激下的血管功能障碍，这一过程与动脉粥样硬化和腹主动脉瘤的形成有关[11]、[12]、[13]。总体而言，lincRNA-p21通过多种分子途径调节心肌细胞和VSMC的行为，涉及转录调控、miRNA相互作用和应激反应信号传导[14]。然而，lincRNA-p21在血管钙化中的具体作用尚未完全阐明，需要进一步的研究来发现新的治疗靶点。基于lincRNA-p21在血管病理学中的已知作用，本研究旨在阐明其通过小胞外囊泡调控高磷血症驱动的VSMC钙化的潜在机制（图1）。

实验方法

细胞培养

制备35毫升高磷酸盐储备液：将0.714克NaH₂PO₄·H₂O和1.631克Na₂HPO₄·12H₂O溶解在蒸馏水中。溶液经过高压灭菌处理后，用0.22微米滤膜过滤，分装并储存在-20°C。实验使用时，将5毫升储备液加入500毫升DMEM培养基（含有10% FBS和1%青霉素-链霉素）中，配制成2.6 mM的高磷酸盐培养基。使用的冷冻小鼠主动脉平滑肌细胞（MASMC）来自iCell Bioscience公司（上海）。

磷酸盐诱导的MASMC钙化

研究表明，在MASMC钙化过程中，钙沉积增加且细胞功能发生改变。如图2所示，磷酸盐（2.6 mmol/L）以时间依赖的方式引发了三种显著现象：钙化能力增强（图2A）、内质网网络结构重组（图2B）以及细胞内钙离子逐渐积累（图2C）。

讨论

血管钙化是一个涉及VSMC成骨转化的活跃过程[15]、[16]、[17]。我们的实验表明，lincRNA-p21在磷酸盐诱导的VSMC凋亡和钙化中起关键作用。磷酸盐通过上调成骨相关标记物（BGP、OCN、OPN）[18]、[19]促进VSMC的成骨分化，这与我们的发现一致。同时，细胞内钙稳态和内质网功能也是重要的调节因素。

作者贡献声明

Hao Jianbing：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据验证、项目管理、方法设计、实验实施、资金获取、数据分析及数据整理。Siyu Wang：负责撰写、审稿与编辑、数据验证、软件使用、项目管理、方法设计及实验实施。Lirong Hao：负责撰写、审稿与编辑、数据验证、项目管理、实验实施及资金获取。

利益冲突

本研究不存在利益冲突。

数据获取

本研究使用和分析的数据集可向相应作者申请获取。

资助

本研究得到了深圳市科技计划（项目编号JCYJ20220530112606015和JCYJ20240813093804007）、深圳市南山区医学三项工程（项目编号SZSM202103002）以及深圳市博士后研究基金的支持。

利益冲突声明

本研究不存在利益冲突。