《Human Immunology》：A Comprehensive comparative assessment of mean Fluorescence Intensity of Luminex single Antigen bead tests between laboratories and commercial platforms: A report from the Italian Histocompatibility Network
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供体特异性HLA抗体检测中Luminex单抗原 bead平台间MFI值变异评估及校正研究。采用意大利国家移植中心协调的20家实验室，比较Thermo Fisher和Werfen两种平台的HLA I类和II类抗体荧光强度均值变异系数均低于20%，但存在显著系统偏差，I类约1/3差异，II类约3/4差异，需建立平台间转换公式以统一器官分配系统标准。
安东尼娜·皮亚扎（Antonina Piazza）|乔瓦尼·隆博拉（Giovanni Rombolà）|翁贝托·马焦雷（Umberto Maggiore）|达里奥·恰皮（Dario Ciappi）|埃马努埃莱·科齐（Emanuele Cozzi）|玛丽亚·基亚拉·德·斯特凡诺（Maria Chiara de Stefano）|罗伯托·克罗基奥洛（Roberto Crocchiolo）|安德烈亚·里奇（Andrea Ricci）|马西莫·卡迪洛（Massimo Cardillo）|瓦莱里亚·米奥蒂（Valeria Miotti）|朱塞佩·费尔特林（Giuseppe Feltrin）|弗兰科·帕波拉（Franco Papola）
意大利国家移植中心（Italian National Transplant Centre），罗马，意大利
摘要
在器官移植的临床决策中，对供体特异性HLA抗体的可靠和可重复检测至关重要。在这项来自意大利移植网络的前瞻性多中心研究中，我们评估了使用两种商业可用平台（供应商1和供应商2）的Luminex单抗原珠（SAB）检测方法在不同实验室之间平均荧光强度（MFI）值的可重复性和可能的偏差。两种供应商的实验室间MFI中位变异系数均低于20%。我们评估了供应商之间的MFI偏差。在具有临床意义的1000–10000 MFI范围内，观察到I类SAB的MFI偏差较大，供应商1的MFI约为供应商2的三分之一（供应商1的MFI = 0.36，供应商2的MFI = 0.74）。对于II类抗原，MFI偏差较小，约为供应商2的四分之三（供应商1的MFI = 0.74，供应商2的MFI = 1.00），但某些DQ等位基因的结果存在差异。最终，我们确定了当前意大利国家肾脏分配系统中用于判断阳性及允许性DSA的最佳临界值（分别为1000和3000）。这些临界值对于供应商1分别为500/1000和500/2000，而对于供应商2则为1000/3000。
总体而言，我们开发了一种工具，用于比较不同平台之间的MFI值，以确保实验室间DSA分配的一致性，并为器官移植做出最合适的临床决策。
引言
Luminex HLA I类和II类单抗原珠（SAB）检测方法是检测和表征供体特异性HLA抗体（DSA）的标准方法，既用于移植前风险评估，也用于移植后监测[1]。尽管SAB检测被列为半定量检测，但临床协议和指南中经常使用平均荧光强度（MFI）值[2]。值得注意的是，许多中小型移植网络，尤其是在欧洲，建议使用基于参考MFI的临界值来列出不允许的抗体[3,4]。此外，现在还使用参考MFI值来排除高度敏感患者的DSA[5,6]，特别是对于使用imlifidase技术的移植，这些参考值通常来自Thermofisher[7]或Werfen平台[8]。然而，在这些分配方法中，基于MFI的临界值并不被推荐作为特异性判断和是否进行移植的唯一标准[9]。必须考虑其他参数，即在等位基因和表位水平上的抗体分析总体模式及其与相关致敏事件的关系，以避免误导性的免疫学建议。最终，任何决策都应由评估免疫学风险和临床益处的移植团队做出[10]。无论如何，不同实验室之间MFI值的显著差异可能导致移植网络中的临床决策不一致。
SAB检测的结果可能受到诸如珠子饱和度、补体干扰以及由于抗原变性引起的假阳性反应等混杂因素的影响[11,12]。此外，多项研究表明，MFI读数在实验室内部和之间存在较高变异性。美国组织相容性学会（ASHI）的能力测试回顾性分析显示，如果使用不同的商业平台，实验室间抗体特异性判断经常存在分歧，这可能对器官分配产生影响[13]。Reed的一项研究显示，在采用统一的标准操作程序后，七个美国核心实验室之间的MFI变异系数（CV）高达25%[14]。其他研究也证实了需要标准化协议以提高实验室间的一致性，尤其是在使用不同供应商的SAB试剂盒时[15,16]。
此外，两种商业可用的SAB平台在制造过程、读数归一化以及基于软件的阳性特异性判断方面存在显著差异[17]。最近的一项研究揭示了两种试剂盒之间MFI值的显著偏差[18]。另一项临床研究也报告了两种供应商在预测肾脏移植中的抗体介导的排斥反应时存在不同的最佳临界值[19]。
有研究提出了一种基于非线性双曲线回归的不同模型来解释这两种试剂盒之间的相关性[20]。该模型显示了高相关性（特别是在校正自体抗原背景后），并能够从两种平台插值MFI值，证实了I类和II类HLA SAB测量结果的显著差异。
当在器官共享项目中使用来自不同实验室和平台的数据时，可靠且一致的检测方法变得更加不可或缺。意大利移植网络包括不同区域的移植项目，由国家移植中心（CNT）协调。对于死亡供体的肾脏移植，2019年引入了一种名为INKA（意大利国家肾脏分配）的独特分配算法[21]。在该算法中，根据MFI值将DSA列为不允许的，并在国家级分配项目中（如针对高度敏感患者的肾脏国家项目PNI）使用相同的临界阈值[22]。迄今为止，INKA和PNI都使用相同的临界值，而不考虑平台的不同。
在本文中，我们报告了一项由意大利免疫遗传学和组织相容性学会（AIBT）支持、与CNT合作进行的大型前瞻性多中心研究的结果，旨在标准化网络内各实验室的SAB检测。研究设计包括分析20个实验室使用的10份血清样本，这些实验室采用了临床实践中常用的试剂盒和标准化程序。
本研究的主要目标是评估不同实验室之间MFI值的变异系数（CV），并比较各实验室使用两种不同SAB试剂盒获得的MFI中位值。这项工作的最终目标是确定一个校正因子（即偏差），以便使用不同平台的实验室能够提供可比的结果。
部分内容摘要
实验室和血清样本
共有20个组织相容性实验室参与了这项研究，其中包括意大利移植网络的17个核心实验室和3个重要的骨髓移植中心实验室。每个实验室匿名收到了来自先前CNT质量控制集的10份共识阳性血清样本。这些血清样本涵盖了大多数（>90%）HLA I类和II类抗原特异性。
由于本研究基于历史数据，因此无需IRB/IACUC的批准
实验室间的变异性
图1a显示了各实验室MFI值的百分比CV，以箱形图形式呈现，包括中位数和四分位数范围（IQR）。
对于供应商1，共评估了960个I类抗原珠（10份血清，每份血清96个珠子）和864个II类抗原珠（9份血清，每份血清96个珠子）。I类和II类HLA SAB的MFI中位CV均约为15%，六个选定位点的范围在13.1%到16.7%之间（图1b）。
对于供应商2，共评估了970个I类抗原珠（10份血清，每份血清97个珠子）和950个II类抗原珠（10份血清）
讨论
准确识别和量化抗HLA抗体对于移植受体的管理至关重要。
我们的研究表明，两种商业可用的Luminex SAB试剂盒在定性相关性和可重复性（即CV）方面表现相似，但在MFI值的定量相关性方面表现较弱，I类HLA的偏差较大，II类HLA的偏差较小，某些DQ等位基因的结果也存在差异。
Luminex SAB是
CRediT作者贡献声明
安东尼娜·皮亚扎（Antonina Piazza）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，数据管理，概念构思。乔瓦尼·隆博拉（Giovanni Rombolà）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，数据管理，概念构思。翁贝托·马焦雷（Umberto Maggiore）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，数据分析，概念构思。达里奥·恰皮（Dario Ciappi）：方法学，数据分析。埃马努埃莱·科齐（Emanuele Cozzi）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
