G-Bot：集成液体处理与活细胞成像的一体化平台推动生命科学研究自动化

《Nature Communications》：An integrated platform for liquid handling and cell imaging in life science applications

为解决传统液体处理与成像系统分离或集成成本高昂的问题，研究人员开发了G-Bot这一紧凑型五轴平台。该研究将自动化液体处理、活细胞成像和实时数据处理集成于单一系统，能够执行细胞接种、药物剂量添加、培养基更换等复杂工作流，并维持稳定的培养环境。结果表明，G-Bot以低于1万美元的成本实现了纳升级精度的液体操作和高分辨率成像，显著提高了实验的可重复性和效率，为小型实验室提供了可及的自动化解决方案。

　　

在生命科学和生物医学研究领域，精确的液体操作和高质量的细胞成像如同实验人员的“左右手”，是推动科学发现的基础。然而，这两大关键技术在传统实验室中常常是“分而治之”——昂贵的自动化液体工作站和高内涵成像系统往往价格不菲，且需要复杂的整合，令许多学术实验室和小型研究机构望而却步。另一方面，手动操作虽然灵活，但面临着重复性差、通量低、易引入人为误差等诸多挑战，尤其是在需要长时间观察细胞动态反应的实验中，难以保证条件的恒定和结果的可靠性。这种“自动化鸿沟”在一定程度上限制了研究的标准化和可重复性。

为了解决这一难题，来自土耳其伊兹密尔生物医学与基因组中心（Izmir Biomedicine and Genome Center）的Meryam Beyza Avci、Furkan Kocer、Fatma Kurul和Arif E. Cetin等研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的研究成果，介绍了一款名为G-Bot的一体化平台。G-Bot的核心创新在于它将自动化液体处理、实时活细胞成像以及环境控制等功能巧妙地集成在一个紧凑且成本可控（低于1万美元）的台式设备中。研究人员旨在打造一个“一站式”的实验工作站，让研究人员能够在一个稳定、可控的环境下，无缝完成从样品制备、药物干预到实时观察和数据分析的完整流程，特别适用于需要长时间监测的细胞实验，如药物筛选、毒理学评估和细胞行为学研究。

为了构建G-Bot，研究人员综合运用了几项关键技术。平台的核心是一个五轴运动控制模块（Control Module），它整合了三轴计算机数控（CNC）系统、一个线性平台（第四轴）和一个旋转平台（第五轴），实现了样品在X、Y、Z方向以及旋转倾斜方向上的精确定位。液体处理功能由流控模块（Flow Module）实现，该模块基于注射泵（syringe pump）和旋转阀（rotary valve），通过聚四氟乙烯（PTFE）管路进行无死体积的液体传输，能够精确处理低至80纳升的液体体积，变异系数（CV）低于5%。成像模块（Imaging Module）采用直立式光路设计，配备5倍长工作距离物镜和CMOS相机，实现了约3.1微米的分辨率和2.1 mm x 1.3 mm的大视场（FOV）成像。为了维持细胞活性，系统还集成了两个环境控制单元：孵育模块（Incubator Module）为整个工作区域提供稳定的温度（37°C）、湿度（~93%）和CO₂（5%）环境；而载物台顶部调节模块（Stage-Top Regulation Module）则专门为实时成像区域的样品提供局部的温控和气控。此外，研究人员还开发了专用的软件模块（Software Module），集成了图像拼接（Image Stitching）、聚焦堆栈（Focus Stacking）和细胞融合度（Confluency）分析等算法，并通过图形用户界面（GUI）统一控制所有硬件操作和数据处理流程。研究所用的细胞系（MCF-7, L929, Jurkat）和斑马鱼幼虫（wild-type AB strain）均为实验室常用模型。

研究成果

大型视场成像与G-Bot

G-Bot的成像模块具备大视场和高分辨率的特点。通过使用定制的96个LED阵列和漫射片，系统能够为96孔板等样品提供均匀照明。测试表明，该模块能够清晰成像多种生物样本，包括48小时大的野生型AB品系斑马鱼幼虫、兔直肠组织、MCF-7乳腺癌细胞和L929小鼠成纤维细胞，展示了其在生命科学应用中的广泛适用性。

G-Bot的精密液体处理

流控模块通过注射泵和旋转阀的协同工作，实现了高精度的液体分液和抽吸。体积精度测试显示，在分液80纳升至1微升的去离子水时，误差小于5%，且重复操作的变异系数（CV）始终低于5%。在Jurkat细胞接种实验中，不同目标细胞密度下的接种误差也低于5%，CV低于4%，证明了其在细胞接种应用中的优异重复性。该模块还能执行培养基更换、系统自清洁等复杂操作。

流控模块实现对精密样品的温和液体处理

与手动移液相比，G-Bot在清洗弱贴壁的MCF-7细胞时，能显著减少细胞损失。经过不同次数的PBS清洗后，G-Bot处理组剩余的细胞数量（通过Hoechst 33342染色荧光强度评估）始终高于手动操作组，证明了其液体处理过程对细胞更温和，精度更高。

五轴控制实现高精度液体处理和成像

五轴控制模块通过三轴CNC、线性平台和旋转平台的协同工作，实现了成像和液体处理功能的顺序执行而互不干扰。旋转平台可倾斜10度，使管路能从孔壁进行液体操作，避免损伤孔底样品。定位精度测试表明，在20厘米行程内重复移动23次，最大定位误差小于5微米。该模块的协同操作还能通过吸除培养基来消除折射率不匹配引起的图像模糊，获得更清晰的细胞图像。

无污染液体处理与管路尖端清洗

通过将沾染了高浓度DAPI染料的管路尖端在PBS清洗瓶中多次蘸洗，并测量残留荧光强度，研究人员证明，经过三次蘸洗后，管路尖端的荧光强度即可降至与纯PBS相同的水平，表明清洗程序能有效避免不同样品间的交叉污染。

G-Bot通过旋转摇动促进均匀细胞接种与生长

旋转平台的摇动模式能显著改善细胞接种的均匀性。实验显示，在6孔板中接种MCF-7细胞时，开启摇动模式可使细胞分布均匀，促进均匀贴壁和生长；而未摇动的对照组则出现明显的细胞聚集和不均匀分布，48小时后细胞活力和形态完整性更差。

G-Bot的精密环境控制

孵育模块采用比例-积分-微分（PID）控制器算法，能够将内部环境的温度稳定维持在37°C（波动±0.3°C），CO₂浓度维持在5%（波动±0.2%），湿度维持在93.6%（波动±0.8%），为长时间细胞培养提供了稳定的环境。

用于成像稳定性的局部环境调节

载物台顶部调节模块作为一个局部环境控制单元，能在成像位点直接维持温度（37°C ±0.5°C）和CO₂浓度（5% ±0.1%），支持长达数小时甚至数天的活细胞长时间成像，而无需将样品移出培养环境。

G-Bot评估细胞融合度

软件模块中的细胞融合度分析算法结合了方差滤波和熵滤波，能够自动计算培养器皿表面被细胞覆盖的百分比。该算法能准确识别不同融合度水平的细胞图像，为细胞培养标准化和药物效应评估提供了量化工具。

G-Bot创建扩展景深图像

针对三维样本（如类器官）景深浅的问题，G-Bot集成了聚焦堆栈功能。该算法通过计算不同焦平面图像的拉普拉斯（Laplacian）响应，选取每个像素点最清晰的来源，合成一张整体清晰的图像。例如，通过堆叠319张图像，成功获得了悬浮在1毫米厚基质胶中的Huh-7细胞5天球体的清晰全景图像。

G-Bot实现大视场图像

图像拼接算法能够将多张相邻图像自动对齐并融合成一张大视场高分辨率图像。通过对人输卵管组织病理切片（拼接23张图像，视场4.4 mm x 3.3 mm）和整个小鼠胚胎（拼接294张图像，视场16.6 mm x 11.08 mm）的扫描成像，证明了G-Bot具备类似商业玻片扫描仪的大范围成像能力。

G-Bot的集成聚焦堆栈与图像拼接能力

G-Bot能够将聚焦堆栈和图像拼接技术结合使用。以斑马鱼幼虫为例，先对两个不同区域分别进行聚焦堆栈（共64张图像）以扩展景深，再将这两个清晰区域拼接起来，最终获得一张既覆盖整个样本又整体清晰的大视场图像。

G-Bot的自动化双色染色

G-Bot能够执行复杂的样品制备流程。以L929和MCF-7细胞的双色荧光染色为例，G-Bot可以自动化完成细胞接种、培养、固定、透化、Phalloidin（标记F-肌动蛋白）和DAPI（标记细胞核）染色以及PBS清洗等一系列步骤，最终获得高质量的荧光和共聚焦显微镜图像。该能力也成功应用于斑马鱼幼虫的染色。

G-Bot的精密药物剂量添加

利用其高精度液体处理能力，G-Bot能够制备从0.1 nM到500 nM的宽浓度范围的紫杉醇（Paclitaxel, PTX）溶液用于药物处理。MTT实验和G-Bot自身的融合度分析均显示，PTX对MCF-7细胞的抑制作用随浓度和时间增加而增强，验证了G-Bot在药物筛选应用中的可靠性。

G-Bot实现自动化精密液滴生成

通过精确控制分液体积（0.2-0.35微升）和管路位置，G-Bot能够生成形状和尺寸高度均匀的液滴（直径0.8-1.3毫米，变异系数低于7%），并可用于创建预定义图案的微阵列，展示了其在微滴相关应用中的潜力。

利用载物台顶部调节模块进行长期实时成像

为了避免吸液对细胞生长的影响，研究人员开发了一种简单的对比度增强方法——在样品下方放置打印的黑白网格板。结合图像预处理算法，该方法能在不干扰培养环境的情况下获得足够的对比度用于活细胞观察。在24小时的长时间成像实验中，G-Bot成功监测了MCF-7细胞在稳定环境下的增殖过程（融合度从45%增至70%）。此外，G-Bot还能实时追踪细胞贴壁的动态过程（1-5小时）以及短时效应，如胰蛋白酶消化引起的细胞脱落（7分钟）和二甲基亚砜（DMSO）诱导的细胞毒性反应（30分钟）。

研究结论与意义

G-Bot的成功开发为生命科学研究实验室，特别是学术机构和小型研究团队，提供了一个高度集成、经济实用且功能强大的自动化解决方案。它巧妙地解决了传统方法中液体处理与成像分离、高成本以及操作复杂性之间的冲突。通过将精密液体处理（可达纳升级）、高分辨率成像（大视场与单细胞精度）、稳定的环境控制（全局孵育与局部调节）以及先进的图像分析算法（融合度分析、图像拼接、聚焦堆栈）整合于一个紧凑平台，G-Bot显著简化了工作流程，提高了实验的可重复性和数据产出效率。

与BioTek Cytation系列等商用系统相比，G-Bot不仅在成本上具有巨大优势（低于1万美元），其独特的五轴设计、旋转摇动功能、无管路死体积的流控系统以及独立的环境控制模块，使其在均匀细胞接种、温和样品处理、长期活细胞观测和复杂实验流程自动化方面展现出独特价值。研究通过一系列生物学实验，如实时细胞贴壁追踪、药物 cytotoxicity 评估、酶促消化观察等，充分验证了G-Bot在真实研究场景下的实用性。

尽管G-Bot目前主要面向实验室规模的单板操作，其模块化设计和开源软件框架为未来的功能扩展（如集成荧光成像、更高倍率物镜、机器学习分析、与OMERO等开放科学平台对接）留下了空间。总之，G-Bot的出现有望“民主化”实验室自动化技术，降低先进研究工具的门槛，推动更多小型实验室开展高质量、可重复的细胞生物学研究、药物发现和再生医学等领域的工作。