CSP15通过隔离作用和抑制生物活化作用来减轻氯吡硫磷对Nilaparvata lugens（一种害虫）的毒性

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：CSP15 attenuates chlorpyrifos toxicity through sequestration and bioactivation suppression in Nilaparvata lugens

氯吡甲胺抗性褐飞虱中CSP15介导的解毒机制及转录调控研究，通过比较转录分析、RNA干扰和结构生物学揭示CSP15通过高亲和力结合氯吡甲胺并抑制其代谢活化酶CYP6BD12，同时受转录因子Lim1β调控。

　　本研究聚焦于农业害虫对杀虫剂产生抗性的复杂机制，特别是通过非经典路径来实现的抗性。以褐飞虱（*Nilaparvata lugens*）为研究对象，这种害虫是全球水稻生产中最具破坏性的农业害虫之一，能够造成超过20%的年产量损失，其对多种杀虫剂的抗性进化速度之快令人担忧。传统的抗性机制通常包括靶点突变和代谢解毒，但随着抗性水平的不断上升，研究者发现越来越多的非经典抗性策略正在发挥作用。本研究通过比较转录分析、RNA干扰和异源表达等方法，揭示了CSP15在氯吡磷（CPF）抗性中的关键作用，为害虫抗性管理提供了新的视角。

在农业害虫的抗性研究中，杀虫剂的使用强度和频率是导致抗性迅速发展的主要因素。CPF是一种广泛使用的有机磷杀虫剂，其作用机制是通过抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性，干扰害虫神经系统的正常功能。然而，随着CPF在田间的广泛使用，许多害虫种群已经发展出对这种杀虫剂的抗性。在这一背景下，研究者发现害虫不仅通过靶点突变来逃避CPF的作用，还可能通过改变代谢路径来降低其毒性。这一发现挑战了传统的抗性模型，表明害虫抗性可能涉及更为复杂的机制。

为了深入理解CPF抗性机制，研究者首先对褐飞虱的不同抗性表型进行了转录分析。通过比较CPF敏感株系（Sus）和抗性株系（Res）的基因表达情况，发现有五种CSP基因在抗性株系中显著上调。其中，CSP15的表达水平在抗性株系中达到42.98倍的过表达，显示出其在CPF抗性中的重要作用。为了验证这一发现，研究者进行了RNA干扰实验，结果表明CSP15的沉默显著增加了CPF的敏感性，证明其在抗性形成中的关键地位。此外，通过将CSP15在细菌中表达，研究者发现其能够显著提高CPF的耐受性，进一步支持了其在抗性机制中的功能。

为了更深入地探讨CSP15如何影响CPF的生物激活过程，研究者进行了竞争性荧光结合实验。实验结果表明，CSP15对CPF的结合能力比其有毒代谢产物氯吡磷氧化物（CPO）更强，其解离常数（*K*_i）为3.32 μM，而CPO的解离常数为6.00 μM。这意味着CSP15能够更有效地结合CPF，从而减少其在体内的生物激活。为了进一步理解这种结合机制，研究者进行了结构建模，发现CPF的结合位点主要由精氨酸84（Arg84）和赖氨酸118（Lys118）介导。相比之下，CPO的结合则依赖于与赖氨酸28（Lys28）形成的四个氢键。通过突变实验，研究者发现K28A突变能够诱导新的相互作用，与Arg84和Lys118形成结构重排，从而显著降低CPO的结合自由能（?40.95 kcal/mol），表明这种突变可能在抗性形成中起到了重要作用。

在CSP15的突变研究中，研究者还发现R84A/K118A双突变体几乎完全丧失了CPF的结合能力，其结合能力下降了62.85–64.37%。这一结果进一步证实了Arg84和Lys118在CPF结合中的关键作用。同时，K28A突变体对CPO的结合能力提高了22.65%，说明CSP15的结构变化可能通过不同的方式影响杀虫剂的代谢路径。这种结构上的适应性变化可能是在长期选择压力下进化形成的，使得CSP15能够更有效地调控杀虫剂的生物激活过程。

在体内代谢分析中，研究者发现CSP15的沉默不仅促进了CPF的降解，还导致了CPO的积累。这一现象支持了CSP15在抑制CPF生物激活中的作用，表明其可能通过降低CPO的形成来减少其毒性。此外，酵母双杂交实验确认了CSP15与CYP6BD12之间的直接相互作用，CYP6BD12是一种负责CPF生物激活的P450酶。这种相互作用可能通过抑制CYP6BD12的活性，从而限制CPF转化为CPO的过程，进而降低其毒性。这一发现为理解CSP15在抗性中的双重机制提供了直接的证据。

除了直接的结合和调控作用，CSP15的表达还受到转录因子Lim1β的调控。研究者发现，Lim1β通过两个保守的启动子* cis*元件调控CSP15的表达。这一发现表明，CSP15的过表达可能是通过特定的转录调控网络实现的，而这种网络可能与其他抗性相关基因的表达存在协同效应。Lim1β在昆虫发育过程中具有重要的调控作用，但其在杀虫剂抗性中的具体功能仍不清楚。本研究首次揭示了Lim1β在CSP15表达中的关键作用，这为未来研究昆虫抗性调控网络提供了新的方向。

在抗性机制的探索中，研究者还注意到CSPs在不同害虫中的广泛存在，且其在抗性进化中的作用具有高度的保守性。例如，在*Conopomorpha sinensis*、*Rhopalosiphum padi*和*Spodoptera frugiperda*等害虫中，CSPs的过表达与抗性发展密切相关。这种现象提示，CSPs可能在多种害虫的抗性进化中扮演了相似的角色，即通过改变杀虫剂的代谢路径或结合能力来降低其毒性。此外，CSPs的功能多样性也为其在抗性中的作用提供了理论基础，因为它们能够通过不同的结合方式和结构变化来适应不同的杀虫剂。

在研究过程中，研究者还发现CSPs不仅作为杀虫剂的“捕获者”，还可能通过与转录因子的相互作用来调控抗性相关基因的表达。例如，在*Nilaparvata lugens*中，CSPs的过表达可能与特定的转录调控网络有关，这种网络可能整合了多个抗性相关基因的表达，从而形成一种复杂的抗性策略。这种策略可能不仅依赖于单一的基因突变或表达变化，而是通过多个基因之间的协同作用来实现抗性。这种机制的发现对于理解害虫抗性的复杂性具有重要意义，也为开发新的抗性管理策略提供了理论支持。

从生态学角度来看，杀虫剂抗性的快速发展对农业生态系统造成了深远的影响。一方面，抗性害虫的出现导致杀虫剂的使用效率下降，增加了农业生产的成本；另一方面，过度使用杀虫剂可能对环境和非目标生物产生负面影响，威胁生态平衡。因此，研究抗性机制不仅有助于开发更有效的杀虫剂，还能够为生态友好的害虫管理策略提供依据。本研究通过揭示CSP15在CPF抗性中的双重作用，为害虫抗性管理提供了新的思路。

本研究的发现表明，CSP15可能通过两种机制共同作用来实现抗性：一种是高亲和力结合CPF，阻止其转化为有毒的CPO；另一种是通过与CYP6BD12的直接相互作用，抑制其代谢活性。这种双重机制可能使得CSP15成为一种非常有效的抗性因子，因为它不仅能够减少杀虫剂的生物激活，还能够通过改变其代谢路径来降低其毒性。此外，CSP15的表达还受到Lim1β的调控，这表明其抗性作用可能与其他基因的表达存在一定的关联，进一步复杂化了抗性机制。

在实际应用中，这些发现可能对害虫抗性管理产生重要影响。例如，通过靶向CSP15或其调控因子Lim1β，可以开发新的抗性管理策略，如利用基因编辑技术降低CSP15的表达，或通过调控Lim1β的活性来影响CSP15的表达水平。此外，研究者还可以探索CSP15与其他抗性相关基因之间的相互作用，以进一步理解抗性网络的复杂性。这些策略可能有助于延缓抗性的发展，提高杀虫剂的使用效率，并减少对环境的负面影响。

在农业害虫的抗性研究中，除了基因表达和代谢路径的改变，还可能涉及其他复杂的分子机制。例如，某些抗性相关基因可能通过改变细胞膜的通透性来减少杀虫剂的摄入，或者通过改变神经信号传导途径来降低其毒性。这些机制可能与CSP15的作用相互关联，共同构成了抗性网络的一部分。因此，未来的研究需要进一步探讨这些机制之间的相互作用，以全面理解害虫抗性的形成和演化。

从进化角度来看，杀虫剂抗性的出现是害虫适应环境压力的一种表现。在长期的农药选择压力下，害虫种群可能会通过自然选择逐渐演化出新的抗性策略。这种进化过程可能涉及多个基因的协同作用，以及复杂的表型变化。例如，某些害虫可能通过改变代谢酶的活性来降低杀虫剂的毒性，而另一些害虫可能通过改变受体的结构来避免杀虫剂的作用。这些不同的抗性策略可能反映了害虫在不同环境条件下的适应能力，同时也为研究抗性进化的机制提供了丰富的素材。

本研究的发现不仅对农业害虫的抗性管理具有重要意义，还可能为其他领域的研究提供启示。例如，在药物开发和毒理学研究中，CSPs的结合特性可能被用来设计新的药物靶点或开发更有效的药物。此外，CSPs的结构灵活性可能使其成为研究分子识别和信号传导机制的重要模型。这些跨学科的应用表明，CSPs的研究具有广阔的前景。

总的来说，本研究通过结合结构生物学和转录分析，揭示了CSP15在褐飞虱CPF抗性中的关键作用。CSP15不仅能够通过高亲和力结合CPF来减少其生物激活，还能够通过与CYP6BD12的直接相互作用来进一步抑制其代谢活性。此外，CSP15的表达受到Lim1β的调控，这表明其抗性作用可能与更广泛的转录调控网络有关。这些发现为理解害虫抗性的复杂机制提供了新的视角，也为开发更有效的抗性管理策略奠定了基础。未来的研究需要进一步探讨CSP15与其他抗性相关基因之间的相互作用，以及其在不同杀虫剂抗性中的普遍性，以期为农业害虫的可持续管理提供更全面的理论支持和实践指导。