FTO介导的CRTC1 m6A去甲基化与p300和EGR2协同作用，促进急性呼吸窘迫综合征中肺泡基底膜（ECM）的降解

《International Immunopharmacology》：FTO-mediated m6A demethylation of CRTC1 coordinates with p300 and EGR2 to promote alveolar ECM degradation in acute respiratory distress syndrome

m6A依赖的FTO/YTHDF2-CRTC1信号轴通过调控MMP和ADAMTS表达促进ARDS肺损伤，抑制FTO可减轻ECM降解和炎症。

　　急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种严重的肺部疾病，其特征包括急性炎症、肺泡-毛细血管屏障的破坏、肺水肿以及气体交换功能的障碍。这种疾病通常由多种直接或间接的肺部损伤引发，如败血症、肺炎和误吸等。近年来的研究表明，除了炎症和免疫细胞浸润之外，肺泡外基质（ECM）的重塑和降解在ARDS的发病机制中扮演着关键角色。ECM不仅为肺泡结构提供机械支撑，还在细胞信号传导、组织修复和屏障完整性调控中发挥重要作用。在病理状态下，促炎性细胞因子如白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）会诱导基质金属蛋白酶（MMPs）和ADAMTS（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs）家族成员的上调和激活。这些ECM降解酶主要由激活的肺泡巨噬细胞（AMs）、中性粒细胞和上皮细胞分泌。它们的过度活性会导致关键的ECM成分如胶原蛋白I和IV、纤维连接蛋白和弹性蛋白的降解，从而造成肺泡基底膜损伤、肺泡完整性丧失和上皮-内皮通透性增加。这一过程会促进富含蛋白质的液体和免疫细胞进入肺泡空间，进一步加重肺水肿和炎症。此外，ECM的降解不仅反映了组织损伤，还通过创造一个有利于进一步免疫激活和纤维化的环境，主动参与疾病进展。

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物信使RNA（mRNA）中最常见的内部修饰之一，它在基因表达的转录后调控中发挥关键作用。这种动态且可逆的修饰由多种甲基转移酶复合体，称为“writers”，负责安装，其中主要成分包括甲基转移酶样3（METTL3）、甲基转移酶样14（METTL14）和Wilms肿瘤1-相关蛋白（WTAP）。m6A标记被特定的“reader”蛋白识别，如YT521-B同源结构域蛋白家族（YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3）和YT结构域含蛋白（YTHDC1和YTHDC2），这些蛋白通过调控mRNA的稳定性、剪接、输出和翻译效率，影响下游基因表达。而“erasers”或去甲基酶，如脂肪质量与肥胖相关蛋白（FTO）和碱基类似物5（ALKBH5），则负责去除m6A修饰，从而实现对细胞内外信号的动态响应。通过这些协调作用，m6A甲基化能够精细调控参与多种生物学过程的基因表达，包括细胞分化、免疫反应、应激适应和疾病发展。最近的研究发现，m6A修饰在急性肺损伤（ALI）和ARDS的发病机制中具有重要作用，其修饰酶的失调可能影响肺部关键炎症介质和细胞应激反应的调控。例如，在脂多糖（LPS）诱导的ALI中，FTO的表达增加，通过调控TXNIP/NLRP3（硫氧还蛋白相互作用蛋白/含NOD样受体结构域的pyrin结构域蛋白3）炎症小体通路，导致肺泡上皮损伤和促进细胞焦亡。同样，METTL3在败血症诱导的ARDS中被发现能够通过稳定Trim59（三部分结构域蛋白59）mRNA，抑制NF-κB（核因子κB）信号通路，从而减轻炎症和血管渗漏。此外，YTHDF2在肺泡巨噬细胞中被发现通过促进HMOX1（血红素加氧酶1）mRNA的降解，加剧肺部炎症，增加氧化应激和炎症反应。

MMPs和ADAMTSs是两种锌依赖性蛋白酶家族，它们在ECM的降解和重塑中起着至关重要的作用。MMPs能够切割广泛的ECM成分，包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白，而ADAMTSs主要靶向蛋白聚糖，如聚集素和Versican。在不同的生物环境和疾病模型中，MMPs和ADAMTSs的表达模式和调控机制存在显著差异。例如，在慢性炎症小鼠模型中，13个ADAMTS基因（ADAMTS-1、?4、?5、?6、?7、?8、?9、?14、?15、?16、?17、?18和?20）被显著上调，这归因于NCOA3–p300–Runx2（核受体共激活因子3–组蛋白乙酰转移酶p300–Runt相关转录因子2）转录复合体的激活。在饮食诱导的肥胖小鼠中，升高的葡萄糖水平促进了CBP–PGC-1α–Runx2复合体的组装，该复合体结合在ADAMTS4和ADAMTS5的启动子区域，从而增强其转录。此外，在摄入晚期糖基化终产物（AGEs）的小鼠中，PPRC1（PPARG相关共激活因子1）、p300/CBP和活化蛋白-1（AP-1）组成的复合体调控了一组12个MMP基因（MMP1a、?1b、?3、?7、?9、?10、?12、?13、?16、?19、?23和?28）的表达。在ALI和ARDS的发展过程中，多种MMPs和ADAMTSs被发现过度表达。其中，MMP1a、?2、?3、?7、?9、?10和?12在ALI/ARDS中显著上调，其表达被CtBP2（C-末端结合蛋白2）–p300–AP-1复合体转录激活。ADAMTS4则在LPS诱导的ARDS小鼠模型中被发现上调，并且在ARDS患者的肺组织中也检测到其表达升高。功能研究表明，通过小干扰RNA（siRNA）沉默ADAMTS4在肺血管内皮细胞中能够减轻LPS诱导的血管高通透性，表明其在ARDS中内皮功能障碍中的作用。

为了系统地阐明m6A甲基转移酶、去甲基酶和reader蛋白在ARDS发病机制中的作用，以及它们的下游效应物和调控网络，我们对LPS诱导的ARDS小鼠模型中分离的支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞中的所有已知m6A调控因子进行了全面的表达分析。在这些调控因子中，FTO在AMs中显著上调，而YTHDF2则在AMs中明显下调。转录组分析和机制研究揭示了FTO和YTHDF2协同调控CRTC1（CREB调节的转录共激活因子1）mRNA的表达和稳定性。升高的CRTC1蛋白与p300和EGR2（早期生长反应蛋白2）形成转录复合体，进而激活包括四个MMPs（MMP8、?14、?17和?23）和四个ADAMTSs（ADAMTS3、?5、?7和?15）在内的ECM降解酶的表达。通过药理学抑制或敲低FTO，可以有效抑制这些靶基因的表达，无论是在体外还是体内实验中。值得注意的是，FTO的抑制或敲低显著减轻了肺泡ECM的降解，并降低了LPS挑战小鼠的ARDS严重程度。这些发现揭示了在AMs中FTO-YTHDF2–CRTC1信号轴的新机制，该机制促进了ECM重塑并参与ARDS的发病过程，为干预ARDS提供了潜在的治疗靶点。

在ARDS的病理过程中，肺泡巨噬细胞（AMs）和中性粒细胞是关键的参与者，它们通过释放促炎性细胞因子和基质降解酶推动炎症反应和组织损伤。当肺部受到损伤时，AMs迅速分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子，启动炎症级联反应。同时，中性粒细胞会浸润到肺泡空间，释放蛋白酶、活性氧物种（ROS）和中性粒细胞胞外陷阱（NETs），从而加剧ECM的降解。这些细胞的活动不仅直接导致肺泡结构的破坏，还通过促进炎症反应和组织重塑，进一步恶化ARDS的临床表现。因此，深入研究AMs和中性粒细胞在ARDS中的具体作用，对于理解疾病机制和开发新的治疗策略至关重要。

在本研究中，我们通过建立LPS诱导的ARDS小鼠模型，对肺泡巨噬细胞中的m6A调控因子进行了详细的分析。研究发现，在LPS刺激下，FTO的表达显著增加，而YTHDF2的表达则明显减少。这种表达变化提示FTO和YTHDF2可能在ARDS的病理过程中发挥不同的作用。进一步的机制研究表明，FTO和YTHDF2协同作用，调控CRTC1 mRNA的稳定性，从而影响CRTC1蛋白的表达。CRTC1蛋白随后与p300和EGR2形成转录复合体，激活多个ECM降解酶的表达，包括MMP8、?14、?17和?23，以及ADAMTS3、?5、?7和?15。这些酶的活性增加导致肺泡基底膜的降解，增加肺泡-毛细血管通透性，从而加剧ARDS的病理特征。通过药理学手段抑制FTO的活性，可以有效降低这些ECM降解酶的表达，减轻肺泡ECM的破坏，并缓解ARDS的临床症状。这一发现不仅揭示了FTO在ARDS中的重要作用，还表明其可能成为新的治疗靶点。

本研究的结果表明，FTO介导的m6A去甲基化在肺泡巨噬细胞中稳定CRTC1 mRNA，从而促进ECM降解酶（如MMPs和ADAMTSs）的表达，这在ARDS的病理过程中起到了推波助澜的作用。抑制FTO的活性能够有效降低CRTC1的表达，减少ECM的降解，并缓解ARDS的严重程度。这些发现不仅加深了我们对ARDS发病机制的理解，还为开发新的治疗策略提供了理论依据。此外，研究还强调了m6A修饰在调控肺部炎症和组织修复中的重要性，表明这一表观遗传机制可能在其他肺部疾病中也具有类似的调控作用。未来的研究可以进一步探索FTO及其相关调控网络在ARDS中的具体作用机制，并评估其作为治疗靶点的可行性。通过这些研究，我们有望找到更有效的干预手段，以减轻ARDS患者的临床症状并改善预后。