通过高通量筛选技术，确定糖原合成酶激酶3α/β是HBV转录所必需的宿主因子

《Hepatology》：Identification of glycogen synthase kinase 3alpha/beta as a host factor required for HBV transcription using high-throughput screening

HBV通过NTCP进入肝细胞，其复制受宿主因子调控。本研究建立重组HBV报告系统，筛选出GSK3α/β抑制剂AZD1080、CHIR-98014等可显著抑制HBV抗原（HBeAg、HBsAg）表达。磷蛋白组学显示GSK3磷酸化FOXK1/2，其中FOXK2-S424磷酸化对HBV增强子I介导的转录至关重要。双敲除FOXK1/2的细胞中病毒蛋白产量降低，恢复FOXK2-S424D突变体可逆转此效应。此外，GSK3抑制剂未影响cccDNA水平，表明其抑制机制位于转录阶段。该研究揭示了GSK3-FOXK2信号通路在HBV复制中的关键作用，为抗HBV治疗提供新靶点。

　　这项研究聚焦于一种能够引发严重肝脏疾病的人类乙型肝炎病毒（HBV）的复制机制，以及如何通过识别宿主因子来寻找新的抗病毒治疗策略。HBV感染是全球范围内导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要原因之一，因此，寻找有效的抗病毒药物和宿主因子具有重要意义。目前，针对HBV的治疗主要依赖于核苷类似物，这些药物虽然能有效抑制病毒复制，但通常需要长期使用，且难以彻底清除病毒的共价闭合环状DNA（cccDNA），这使得寻找新的治疗靶点成为亟待解决的问题。

为了更深入地理解HBV的复制过程，研究团队构建了一种基于重组HBV的报告基因表达系统，该系统能够模拟HBV从进入宿主细胞到病毒颗粒释放的整个生命周期。通过将NanoLuc基因整合到HBV基因组中，研究人员能够利用荧光信号来实时监测病毒的复制过程。这种系统相较于传统的HBV复制评估方法，具有更高的灵敏度和更广泛的动态范围，使得高通量筛选成为可能。随后，他们使用包含1827种FDA批准化合物的药物库进行筛选，发现了一些能够有效抑制HBV复制的化合物，其中包括已知的GSK3α/β抑制剂，如AZD1080、CHIR-98014、CHIR-98021、BIO和AZD2858。

研究发现，这些GSK3α/β抑制剂能够显著降低HBV相关蛋白HBeAg和HBsAg的表达水平，且不会对细胞造成明显的毒性作用。为了进一步探讨GSK3α/β在HBV复制中的具体作用，研究人员通过蛋白质组学分析发现，GSK3α/β能够磷酸化叉头框蛋白K1/2（FOXK1/2）。在进一步的实验中，他们通过CRISPR-Cas9技术构建了FOXK1/2双敲除细胞系，并发现敲除FOXK1/2能够显著减少HBeAg和HBsAg的表达。值得注意的是，仅恢复FOXK2的表达，而非FOXK1，就能够恢复这些蛋白的生成，这表明FOXK2在HBV蛋白表达中起着关键作用。此外，研究还发现FOXK2在Ser 424位点的磷酸化对于GSK3α/β介导的HBeAg和HBsAg的生成至关重要。进一步的实验表明，FOXK2能够直接与HBV的DNA结合，尤其是在HBV增强子I区域，这一区域含有5′-GTAAACA-3′的序列，与FOXK2的结合偏好一致。

为了验证GSK3α/β对HBV转录的影响，研究人员利用了不同类型的细胞模型，包括HepAD38细胞、HepG2-NTCP细胞和人源性原代肝细胞（PHHs）。结果显示，GSK3α/β的抑制能够显著减少HBV的转录产物，包括HBeAg和HBsAg，而对cccDNA的水平没有明显影响。这一发现表明，GSK3α/β主要参与HBV的转录调控，而不是DNA复制过程。此外，通过染色质免疫沉淀（ChIP）和凝胶迁移实验（gel shift assay），研究人员进一步确认了FOXK2与HBV DNA的结合能力，并发现GSK3α/β的抑制能够减弱这种结合，从而影响HBV的转录效率。

进一步的分子机制研究显示，FOXK2的结合不仅影响HBV的转录，还与RNA聚合酶II的活性密切相关。在GSK3α/β被抑制的情况下，RNA聚合酶II在Ser2和Ser5位点的磷酸化水平降低，这可能与FOXK2的磷酸化状态有关。同时，研究还发现FOXK2的结合与组蛋白H3在赖氨酸4位的三甲基化（H3K4me3）水平相关，这种修饰通常出现在活跃的启动子区域。因此，GSK3α/β通过调节FOXK2的磷酸化，间接影响了HBV的转录活性，从而抑制病毒蛋白的生成。

此外，研究还探讨了FOXK2在HBV相关疾病中的潜在作用。FOXK2不仅与HBV的复制过程相关，还在肝细胞癌（HCC）中扮演重要角色。在HCC中，FOXK2的表达水平较高，且与肿瘤大小、分期和血管浸润程度密切相关。这一发现提示FOXK2可能不仅是一个HBV的调控因子，还可能是一个潜在的肿瘤标志物。同时，研究还发现miR-1271能够靶向FOXK2的3′UTR，从而抑制其表达，进而影响HBV的复制和HCC的发展。这表明，FOXK2可能是一个重要的治疗靶点，不仅针对HBV，还可能对HCC的治疗具有潜在价值。

综上所述，这项研究通过构建一种新的HBV报告系统，成功筛选出了一类具有抗HBV活性的化合物，即GSK3α/β抑制剂。这些抑制剂能够通过影响FOXK2的磷酸化状态，从而抑制HBV的转录过程，减少病毒蛋白的生成。研究还揭示了FOXK2在HBV复制中的关键作用，以及其与HBV DNA结合的具体机制。此外，FOXK2在HCC中的高表达可能与疾病进展有关，这为未来的治疗策略提供了新的思路。通过这些发现，研究人员不仅为HBV的治疗提供了潜在的新靶点，还为理解HBV与宿主之间的相互作用提供了重要的分子基础。这一成果有望推动抗HBV药物的研发，并为慢性乙型肝炎患者的长期治疗提供新的选择。