CCR2/CXCR6增强MSLN CAR-T细胞肿瘤浸润及抗肿瘤效能的机制研究

《Cellular and Molecular Life Sciences》：CCR2/CXCR6 enhances tumor infiltration and antitumor efficacy of MSLN CAR-T cells

CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中面临肿瘤浸润不足的挑战。本研究通过为MSLN靶向的CAR-T细胞引入趋化因子受体CCR2和CXCR6，构建了Intra2和Intra6 CAR-T细胞。结果表明，尤其是Intra6 CAR-T细胞，在体外和体内均表现出更强的迁移、浸润、持久杀伤能力和抗耗竭表型。RNA测序揭示其通过上调LFA-1、PAK1和FSCN1等基因，增强细胞迁移、粘附和细胞骨架重塑。该策略为优化实体瘤CAR-T疗法提供了新思路。

　　

癌症，尤其是实体瘤，一直是人类健康的主要威胁。近年来，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤治疗中取得了革命性成功，为癌症患者带来了新希望。然而，当科学家们试图将这种强大的免疫武器应用于实体瘤时，却遇到了重重阻碍。实体瘤就像一个坚固的堡垒，其内部存在着一个复杂且具有免疫抑制性的肿瘤微环境（TME），这使得CAR-T细胞难以有效浸润到肿瘤内部，即使成功进入，也常常因功能耗竭而无法发挥持久的杀伤作用。这种“看得见却打不着”的困境，严重限制了CAR-T疗法在实体瘤领域的应用前景。

间皮素（MSLN）作为一种在多种实体瘤（如卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌）中高表达的肿瘤相关抗原，成为了CAR-T疗法一个有吸引力的靶点。尽管MSLN靶向的CAR-T细胞（MSLN CAR-T）在临床前研究中显示出潜力，但其临床疗效仍受制于向肿瘤组织的归巢和浸润能力不足。如何突破肿瘤微环境的壁垒，让CAR-T细胞能够“精准导航”并“深入敌后”，成为研究人员亟待解决的关键科学问题。

在这一背景下，发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上的研究论文《CCR2/CXCR6 enhances tumor infiltration and antitumor efficacy of MSLN CAR-T cells》提出了一项创新性策略。研究人员设想，能否通过给CAR-T细胞装备上“导航系统”，帮助它们更好地找到并进入肿瘤组织呢？这个“导航系统”就是肿瘤微环境中过度表达的趋化因子的受体。趋化因子是细胞分泌的小分子蛋白质，能够引导免疫细胞定向迁移。研究人员通过生物信息学分析发现，在卵巢癌等肿瘤中，趋化因子CCL2和CXCL16显著高表达。于是，他们分别将这两种趋化因子的受体——CCR2和CXCR6——基因工程化到MSLN CAR-T细胞中，构建了两种新型CAR-T细胞：Intra2 CAR-T（表达CCR2）和Intra6 CAR-T（表达CXCR6）。

为了验证这一策略的有效性，研究人员开展了一系列严谨的实验。本研究主要采用了以下关键技术方法：利用慢病毒载体系统构建并制备表达CCR2或CXCR6的MSLN CAR-T细胞；通过流式细胞术系统评估CAR-T细胞的表型（如激活、耗竭、记忆亚群标志物）和受体表达；采用Transwell迁移实验和三维（3D）肿瘤微球模型分别在二维和三维水平检测CAR-T细胞的迁移与浸润能力；通过短期、长期及实时细胞杀伤实验评估CAR-T细胞的体外细胞毒性；建立荷瘤小鼠模型（使用B-NKG小鼠及HCC1806等肿瘤细胞系）进行体内疗效和安全性评价；运用RNA测序（RNA-seq）和生物信息学分析揭示CXCR6影响CAR-T细胞功能的分子机制；并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除LFA-1分子以验证其功能重要性。

3.1 Construction and phenotypic function verification of MSLN CAR-T cells

研究人员首先成功构建了MSLN CAR-T、Intra2 CAR-T和Intra6 CAR-T细胞，并证实了CCR2和CXCR6受体的稳定表达。与常规MSLN CAR-T细胞相比，Intra2和Intra6 CAR-T细胞在受到肿瘤抗原刺激后，虽然早期激活标志物（如CD25、CD69）的表达略有降低，但关键的耗竭标志物（如PD-1、TIM-3、LAG-3）的表达水平显著更低，并且表现出更强的增殖能力。这表明引入趋化因子受体可能改善了CAR-T细胞的功能持久性。

3.2 CCR2/CXCR6 receptor enhance the migration and tumor invasion abilities of MSLN CAR-T cells

接下来，通过Transwell迁移实验和3D肿瘤微球浸润实验，研究人员发现Intra2和Intra6 CAR-T细胞，尤其是Intra6 CAR-T细胞，向肿瘤细胞的迁移能力以及向肿瘤球体核心区域的浸润深度均显著优于常规MSLN CAR-T细胞。这直接证明了CCR2和CXCR6的引入有效增强了CAR-T细胞的趋化迁移和肿瘤组织穿透能力。

3.3 CCR2/CXCR6 receptor enhance the killing ability of MSLN CAR-T cells

在功能上，Intra2和Intra6 CAR-T细胞对MSLN阳性的肿瘤细胞系（如HCC1806、Ovcar3、Capan-2）均表现出强大的杀伤能力，且其效力优于常规MSLN CAR-T细胞。实时杀伤动力学分析进一步显示，Intra6 CAR-T细胞能更快、更彻底地清除肿瘤细胞。重要的是，这些改造后的CAR-T细胞对MSLN阴性的细胞（Huh7）没有杀伤作用，表明其抗原特异性得以保留。

3.4 CCR2/CXCR6 maintains the memory stemness of MSLN CAR-T cells and enhances the durable anti-tumor effect

表型分析揭示，Intra2和Intra6 CAR-T细胞含有更高比例的干细胞样记忆T细胞（T_SCM）和中央记忆T细胞（T_CM），而效应记忆T细胞（T_EM）和终末效应T细胞（T_TE）的比例较低。这种记忆表型与更好的体内持久性相关。多轮重复杀伤实验证实，Intra6 CAR-T细胞能够维持更持久的杀伤能力。此外，在与肿瘤细胞共培养后，Intra6 CAR-T细胞释放出更高水平的效应细胞因子（如IL-6、TNF-α、IFN-γ）。

3.5 Intra6 CAR-T cells showed stronger tumor suppressive effects and better immune infiltration ability in vivo

在荷瘤小鼠模型中，与输注PBS或常规MSLN CAR-T细胞相比，输注Intra6 CAR-T细胞能更有效地抑制肿瘤生长，尤其是在能够分泌CXCL16的肿瘤模型中，效果更为显著。从小鼠外周血和肿瘤组织分析发现，Intra6 CAR-T细胞表现出更低的PD-1耗竭标志物表达、更高的T_SCM/T_CM记忆亚群比例，以及更强的肿瘤组织浸润能力。这些结果在体内水平验证了Intra6 CAR-T细胞的优越抗肿瘤活性和浸润特性。

3.6 Safety assessment of Intra6 CAR-T cells

安全性评估显示，接受Intra6 CAR-T细胞治疗的小鼠体重稳定，主要器官（心、肝、脾、肺、肾、脑）的组织学检查未发现明显损伤或炎症迹象，表明Intra6 CAR-T细胞在动物水平具有良好的安全性。

3.7 RNAseq analysis of differential gene expression of MSLN CAR-T cells after CXCR6 implantation

为了深入探究CXCR6增强CAR-T细胞功能的分子机制，研究人员对MSLN CAR-T和Intra6 CAR-T细胞进行了RNA测序分析。结果显示，Intra6 CAR-T细胞中与免疫激活、T细胞迁移/趋化、细胞毒性相关的通路显著富集。特别值得注意的是，与细胞迁移、粘附、细胞外渗（如LFA-1，即淋巴细胞功能相关抗原-1）、细胞骨架重塑（如PAK1，P21激活激酶1；FSCN1，Fascin蛋白）相关的基因表达显著上调。通过RT-qPCR和流式细胞术证实了LFA-1在mRNA和蛋白水平的表达上调。关键的功能验证实验表明，利用CRISPR/Cas9技术敲除LFA-1后，Intra6 CAR-T细胞增强的迁移能力被显著削弱，证明LFA-1是CXCR6驱动迁移所必需的。

综上所述，本研究通过将趋化因子受体CCR2和CXCR6（尤其是CXCR6）引入MSLN靶向的CAR-T细胞，成功增强了其向肿瘤组织的归巢、浸润能力、抗耗竭特性以及持久抗肿瘤功能。其内在机制涉及CXCR6介导的LFA-1、PAK1、FSCN1等基因的上调，从而促进了CAR-T细胞的粘附、迁移和跨内皮浸润过程。这项研究不仅为克服实体瘤CAR-T疗法面临的肿瘤浸润不足这一核心瓶颈提供了有效的策略，还深入揭示了趋化因子受体调控T细胞功能的新机制，为开发下一代更高效的实体瘤免疫治疗方法奠定了坚实的理论基础，具有重要的临床转化前景。同时，研究也指出了未来可能的发展方向，如联合使用可诱导肿瘤微环境中CXCL16表达的疗法（如放疗、化疗），或与免疫检查点抑制剂（如抗PD-1/PD-L1抗体）联用，以进一步提升疗效。