综述：旋毛虫属的分子诊断：现状与未来展望

《Parasitology Research》：Molecular diagnosis of Trichinella spp.: current status and future prospects

本综述系统梳理了旋毛虫病分子诊断技术的研究进展，重点介绍了PCR、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）以及新兴的CRISPR-Cas系统等方法的原理、应用与局限。文章指出，尽管分子技术具有高灵敏度与特异性，但其在食品动物常规检测中的应用仍面临挑战，并展望了CRISPR-Cas等技术在实现现场快速检测（POCT）方面的巨大潜力。

　　

引言

旋毛虫病是一种分布广泛、严重的人畜共患寄生虫病，对公共卫生和畜牧业经济均构成威胁。人类通常因生食或半生食含有旋毛虫幼虫的肉类而感染。尽管近年来全球范围内人类旋毛虫病的发病率和疾病负担呈下降趋势，但局部地区仍有疫情暴发，因此，建立快速、准确的诊断方法对于疾病防控至关重要。

传统聚合酶链式反应（PCR）

PCR技术因其快速、灵敏和特异的特点，已成为旋毛虫遗传诊断和虫种鉴定的重要工具。其检测灵敏度可达0.001 pg（约相当于0.01条幼虫）。研究表明，感染后5天即可在血液中检测到寄生虫DNA。针对寄生虫特异性基因（如β-碳酸酐酶基因）开发的PCR方法，在屠宰场肉类检验、食品工业质量控制和医学实验室中有应用潜力。与人工消化法相比，PCR在检测低寄生虫载量时显示出更高的灵敏度。

然而，单独使用PCR方法检测旋毛虫存在取样误差的风险，尤其是在寄生虫载量低的情况下。此外，较长的反应时间和对专业设备及人员的需求，限制了其在现场快速检测（POCT）和大规模监测中的应用。目前，PCR多与血清学方法结合，或用于旋毛虫基因分型的多重PCR研究。

实时荧光定量PCR（RT-PCR）

RT-PCR技术通过特异性探针与样本DNA杂交，实现了对旋毛虫DNA的定性和定量检测。其灵敏度极高，可检测到低至0.01-7条幼虫/克组织。有研究报道，在感染后第4天即可100%检测到小鼠肌肉中的旋毛虫DNA，优于同时进行的ELISA方法。RT-PCR在流行病学调查和肉类检疫中表现优异，不仅能检测感染，还能在种或基因型水平上进行区分。高分辨率熔解曲线分析（HRMA）技术的结合，进一步提升了其鉴别能力。

尽管如此，RT-PCR的广泛应用仍受限于引物探针设计的难度、对专业设备的依赖以及较高的试剂成本。

微滴式数字PCR（ddPCR）

ddPCR技术结合微流控分区和终点PCR检测，无需标准曲线即可实现绝对定量。该技术对复杂生物基质中的PCR抑制剂具有更强的耐受性，在检测低丰度目标（<1%）时表现出卓越的灵敏度。一项研究利用ddPCR在加拿大北极熊中检测人畜共患病原体，揭示了旋毛虫的高感染率。然而，其技术复杂性、高成本以及低通量等特点，限制了其在临床的广泛采用。

环介导等温扩增（LAMP）

LAMP是一种在等温条件（如63°C）下快速（<70分钟）扩增靶基因的技术，对设备要求低。其在旋毛虫检测中表现出高灵敏度（0.01条幼虫/克肌肉组织），且无交叉反应。LAMP甚至能在感染早期从粪便中检测到旋毛虫DNA，显示出作为现场诊断工具的潜力。

但LAMP也存在非特异性扩增、引物设计复杂、难以进行多重检测以及假阳性风险较高等挑战。成本分析显示，其单次检测成本高于qPCR，这些因素制约了其更广泛的应用。

重组酶聚合酶扩增（RPA）

RPA是另一种等温扩增技术，可在25-45°C下快速（通常<1小时）完成扩增。针对旋毛虫线粒体小亚基核糖体RNA（rrnS）基因开发的RPA结合侧流层析检测（LF-RPA）方法，可在25分钟内检测12种已知旋毛虫，灵敏度达100 fg DNA，且肌肉组织中的潜在抑制剂影响较小。

RPA的主要局限包括易受温度、搅拌等因素影响，引物设计易产生非特异性条带，且仍需核酸提取步骤，限制了其真正的现场部署。优化和验证其在各种环境下检测旋毛虫的性能仍需进一步研究。

CRISPR-Cas技术

CRISPR-Cas系统近年来已发展成为强大的诊断平台。其通过向导RNA（gRNA）进行序列特异性识别，并触发效应蛋白（如Cas12a, Cas13a）对报告分子的非特异性切割，从而产生信号。该系统具有极高的灵敏度（可达attomolar水平）和特异性，且操作简单，在POCT方面优势显著，已在多种病原体检测中应用。

对于旋毛虫检测，CRISPR-Cas系统有望在不依赖专业设备的情况下实现高灵敏度检测。然而，其应用面临的主要挑战包括耗时的核酸提取过程、提取的核酸浓度和纯度可能不理想，以及成本和验证需求。未来的研究应集中于优化样本制备步骤。

结论与展望

分子诊断方法以其高特异性和灵敏度在旋毛虫检测中日益受到重视。热循环方法（如PCR/qPCR）准确性高，适用于早期或低载量感染检测。等温扩增技术（如LAMP, RPA）则提升了现场应用的可行性。然而，这些技术在应用于常规监测和POCT时，仍受限于复杂的工作流程（如DNA提取）、专业基础设施需求以及成本等因素。

未来，开发低成本、自动化、适于现场应用的检测试剂盒，将是推动分子诊断技术更广泛应用于旋毛虫病常规诊断和监测项目的关键。新兴的CRISPR-Cas系统与等温扩增技术（如RPA/LAMP）的整合，为便携式分子诊断带来了广阔前景。