通过阳离子氨基酸工程改造的肽类水凝胶实现持续且高效的抗原递送，从而支持单次注射疫苗的效果

《Nanoscale》：Cationic amino acid-engineered peptide hydrogels for sustained and potent antigen delivery enabling single-administration vaccination

肽水凝胶通过阳离子氨基酸调控抗原递送与免疫应答，单剂注射即可实现长达140天的Th1/Th2平衡免疫保护。

　　肽类水凝胶作为疫苗递送系统的潜力引起了广泛关注。本研究系统地探讨了阳离子残基对肽水凝胶介导的抗原递送和免疫反应的影响，并进一步评估了实现单次剂量免疫的可能性。为了深入研究这一问题，研究者以一种能够自组装成水凝胶的肽Jelleine-1（J-1）为模板，分别设计了两种变体：J-2，通过替换原序列中的赖氨酸（Lys）为精氨酸（Arg）以改变阳离子特性；以及J-3，通过移除阳离子残基。这些肽在抗原溶液中自组装形成三种水凝胶疫苗——Gel 1、Gel 2和Gel 3，分别对应J-1、J-2和J-3。研究重点评估了这些水凝胶的机械性能、持续抗原释放能力、抗原摄取效率以及单次免疫后引发的免疫反应。

实验结果显示，Gel 1和Gel 2中的阳离子纳米纤维与带负电荷的抗原之间存在静电相互作用，这不仅促进了抗原的持续释放，还增强了巨噬细胞和树突状细胞（DCs）在注射部位的富集。此外，阳离子肽能够诱导DC膜去极化，显著提升抗原摄取效率和DC的激活程度。具体而言，Gel 1和Gel 2的抗原摄取效率分别提高了1.6倍和1.8倍，而DC的激活程度则分别增加了3.3倍和3.1倍。这些发现表明，阳离子肽水凝胶具有独特的免疫调节能力，能够有效增强抗原的递送效率和免疫系统的响应。

通过单次免疫，Gel 1和Gel 2能够诱导出强烈且持久的免疫反应，持续时间可达140天，并且能够产生更为平衡的Th1/Th2免疫反应。这种持久性和平衡性为设计单次剂量疫苗提供了重要的理论依据。研究还发现，阳离子肽的引入不仅提高了抗原的释放效率，还促进了免疫细胞的募集和活化，为疫苗的长期免疫保护奠定了基础。

在材料科学的推动下，多种生物材料被用于增强疫苗的效果，例如纳米颗粒、脂质体和水凝胶。水凝胶因其良好的生物相容性和结构可变性，在生物医学领域受到高度重视，尤其是在再生医学、三维细胞培养和药物递送等方面。理论上，固态水凝胶可以构建一个炎症微环境，作为抗原储存库，实现抗原的持续释放和免疫刺激。此外，水凝胶的纤维状微结构模拟了细胞外基质，为免疫细胞的募集提供了支持性支架。同时，水凝胶的多孔三维网络有助于免疫细胞的迁移、原位抗原呈递以及成熟树突状细胞向淋巴结的定向运输。因此，水凝胶被视为一种极具前景的抗原持续递送平台。

肽基纳米材料因其良好的生物相容性、可编程序列以及通过简单物理包封实现抗原封装的能力，被认为是理想的抗原递送平台。例如，Collier等人研究表明，Q11肽纳米纤维无需额外佐剂即可增强抗原的摄取、DC的激活和生发中心的形成，从而提升免疫反应的强度。同样，Yang等人发现，由Npx-GFFY及其类似物形成的水凝胶能够包封多种抗原，并通过简单的物理封装诱导出强烈的免疫反应。尽管这些材料具有诸多优势，但目前大多数报道的肽水凝胶疫苗仍需要多次接种才能达到最佳的免疫原性，这可能与抗原和水凝胶网络之间缺乏足够的特异性相互作用有关。然而，阳离子氨基酸在肽的物理化学性质中扮演着关键角色，其对肽水凝胶介导的抗原递送的影响尚未完全明确。

在本研究中，研究者进一步探讨了阳离子肽水凝胶在抗原递送和免疫反应中的作用。他们发现，阳离子肽能够通过静电相互作用与抗原结合，从而形成稳定的抗原储存结构。这种结合不仅有助于抗原的持续释放，还能促进抗原的高效摄取和免疫细胞的激活。例如，Gel 1和Gel 2能够通过静电作用增强抗原的摄取，使抗原更有效地被DC吸收并呈递给T细胞，从而引发更强的免疫反应。相比之下，缺乏阳离子残基的Gel 3虽然也能形成水凝胶，但其抗原递送效率和免疫反应强度明显较低。

在生物相容性方面，研究者通过体外实验评估了这些水凝胶的安全性。结果显示，Gel 1、Gel 2和Gel 3对Marc 145细胞和小鼠红细胞均表现出良好的生物相容性，细胞存活率均超过95%，且红细胞的裂解率低于5%。这表明这些水凝胶在体内具有较低的毒性和良好的血液相容性，为它们在疫苗应用中的安全性提供了支持。

在抗原释放方面，研究者通过体外和体内实验评估了三种水凝胶的释放特性。体外实验中，所有水凝胶均表现出相似的抗原释放模式，未出现明显的快速释放现象。其中，Gel 3在12天内完全释放了FITC-OVA模型抗原，而Gel 1和Gel 2则需要18天和17天才能达到完整的抗原释放。这表明，阳离子肽的引入通过静电相互作用和物理限制共同抑制了抗原的快速扩散，从而实现了更持久的抗原释放。在体内实验中，通过生物成像系统追踪Cy5-OVA在注射部位的荧光信号，发现Gel 1和Gel 2的荧光信号衰减速度明显慢于Gel 3，进一步验证了其在体内维持抗原释放能力的优越性。

在免疫细胞募集方面，研究者通过体外和体内实验评估了水凝胶对免疫细胞迁移和浸润的影响。体外实验中，所有水凝胶均显著促进DC的迁移，但不同水凝胶之间未观察到显著差异。体内实验显示，注射后5天，所有水凝胶均形成明显的结节，并且这些结节中细胞浸润数量显著增加。其中，Gel 1和Gel 2的结节中细胞浸润量分别为Gel 3的3.3倍和2.2倍。此外，通过流式细胞术分析了浸润细胞的类型，发现Gel 1中约87.7%的细胞为免疫细胞，其中DC和巨噬细胞占85.4%。这些结果表明，阳离子肽水凝胶能够有效促进免疫细胞的募集和浸润，为免疫反应的启动提供了必要的细胞基础。

在抗原摄取和DC激活方面，研究者发现阳离子水凝胶能够通过诱导DC膜去极化来增强抗原的摄取效率。体外实验中，使用DiBAC4(3)荧光探针检测DC膜电位的变化，发现Gel 1和Gel 2显著增强了DC膜的去极化程度，从而提高了抗原的摄取能力。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察到，Gel 1和Gel 2的抗原摄取效率分别比Gel 3提高了1.6倍和1.8倍。此外，流式细胞术结果显示，Gel 1和Gel 2显著提升了DC的共刺激分子CD80和CD86的表达水平，以及MHC-I和MHC-II的表达水平，表明这些水凝胶不仅促进了DC的成熟，还增强了其抗原呈递能力。

在免疫反应的评估中，研究者通过ELISA和ELISpot等方法检测了抗原特异性免疫反应的强度和持续性。结果显示，单次注射Gel 1和Gel 2能够诱导出持续时间长达140天的强效抗原特异性抗体反应，而PBS组的抗体水平仅短暂升高。此外，Gel 1和Gel 2还显著增强了Th1和Th2免疫反应的平衡性，其IgG1和IgG2a的水平均显著高于PBS组。通过ELISpot检测发现，Gel 1和Gel 2能够显著提升IL-4和IFN-γ的分泌水平，分别增强了Th2和Th1反应的强度。这些结果表明，阳离子肽水凝胶能够有效诱导出多方面的免疫反应，为单次剂量疫苗的设计提供了新的思路。

此外，研究者还评估了水凝胶诱导的免疫记忆效应。通过体外刺激免疫小鼠的脾细胞，发现Gel 1和Gel 2能够显著提升脾细胞的增殖指数，表明它们能够诱导出持久的免疫记忆。相比之下，Gel 3对脾细胞的增殖没有明显促进作用，进一步说明其在诱导免疫记忆方面的局限性。

综上所述，本研究发现阳离子肽水凝胶在抗原递送和免疫反应方面表现出显著的优势。它们不仅能够通过静电相互作用和物理限制实现抗原的持续释放，还能有效促进免疫细胞的募集和活化，增强DC的成熟和抗原呈递能力，从而诱导出强效且持久的免疫反应。这些发现为开发单次剂量疫苗提供了重要的理论基础和实验依据，同时也为未来疫苗设计中的材料选择和优化提供了新的方向。