Cdk5通过EZH2-GLS1轴调控结直肠癌谷氨酰胺代谢的作用与机制研究

《Cancer & Metabolism》：Cdk5 regulates glutamine metabolism in colorectal cancer via the EZH2-GLS1 axis

本研究针对结直肠癌（CRC）中谷氨酰胺（Gln）代谢异常调控机制不清的问题，探讨了细胞周期蛋白依赖性激酶5（Cdk5）在其中的作用。研究人员通过体外细胞模型和体内动物实验发现，Cdk5通过磷酸化EZH2，进而通过PRC2复合物催化产生抑制性标记H3K27me3，调控谷氨酰胺酶1（GLS1）等代谢相关基因的表达，影响线粒体功能和三羧酸循环（TCA），最终抑制CRC细胞的增殖和迁移。该研究揭示了Cdk5-EZH2轴在CRC代谢重编程中的新机制，为靶向谷氨酰胺代谢的CRC治疗提供了新思路。

　　

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，其发生发展机制复杂，给临床防治带来了巨大挑战。近年来，肿瘤代谢重编程，尤其是氨基酸代谢异常，被认为是癌症的重要特征之一。其中，谷氨酰胺（Glutamine, Gln）作为血浆中最丰富的氨基酸，在癌细胞能量产生、氧化还原稳态、生物大分子合成以及信号转导等方面扮演着关键角色。许多癌细胞表现出对谷氨酰胺的“成瘾性”，即高度依赖谷氨酰胺来维持其快速增殖。因此，深入解析谷氨酰胺代谢在结直肠癌中的调控机制，对于开发新的治疗策略具有重要意义。

细胞周期蛋白依赖性激酶5（Cyclin-dependent kinase 5, Cdk5）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，最初被发现主要在神经元发育和功能中发挥作用。然而，越来越多的证据表明，Cdk5在多种癌症中异常表达，并与肿瘤的增殖、迁移、血管生成乃至化疗耐药性相关。我们前期的研究也发现Cdk5在结直肠癌组织中高表达，并能促进结直肠癌细胞的恶性进展。那么，在结直肠癌的代谢重编程中，Cdk5是否也扮演着重要角色？它是否参与调控了癌细胞对谷氨酰胺的利用？这些问题亟待解答。

为了回答上述问题，吴启龙、朱晓彤等研究人员在《Cancer & Metabolism》上发表了一项题为“Cdk5 regulates glutamine metabolism in colorectal cancer via the EZH2-GLS1 axis”的研究。该研究综合利用了人类结直肠癌细胞系（如SW480和DLD-1）和小鼠结直肠癌模型，通过基因敲低、药理学抑制、分子生物学、代谢组学以及微生物组学等多种技术手段，深入探究了Cdk5在调控结直肠癌细胞谷氨酰胺代谢中的具体作用及其分子机制。

研究人员首先确认了谷氨酰胺对结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移和细胞周期进程的促进作用。随后，他们发现敲低Cdk5能够显著抑制谷氨酰胺对癌细胞这些恶性表型的促进作用。机制上，研究揭示Cdk5与表观遗传调控因子EZH2（Enhancer of Zeste Homolog 2）发生物理相互作用，并磷酸化EZH2。磷酸化的EZH2进而通过其所在的PRC2（Polycomb Repressive Complex 2）复合物，催化组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me³），这是一种经典的转录抑制标记。该修饰特异性地作用于谷氨酰胺代谢的关键酶——谷氨酰胺酶1（Glutaminase 1, GLS1）的启动子区域，抑制其转录表达。

有趣的是，尽管Cdk5敲低导致谷氨酰胺转运蛋白ASCT2和GLS1的蛋白水平上调，但细胞的能量状态却受到影响。进一步的研究表明，Cdk5敲低损害了线粒体功能，降低了线粒体膜电位，并抑制了三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle, TCA cycle）中关键酶（如柠檬酸合酶，Citrate Synthase, CS）的表达和活性代谢物（如柠檬酸、苹果酸等）的水平，最终导致ATP生成减少。这表明Cdk5通过EZH2-GLS1轴调控谷氨酰胺分解代谢的同时，也深刻影响着线粒体对谷氨酰胺碳源的利用效率，从而整体上调控了癌细胞的代谢稳态。

在动物实验中，研究人员利用AOM（氧化偶氮甲烷）/DSS（葡聚糖硫酸钠）诱导的小鼠结直肠癌模型，发现补充谷氨酰胺会加重肠道炎症、破坏肠道屏障、导致肠道菌群失调（如有益菌乳酸杆菌减少，有害菌脱硫弧菌增多），并加速肿瘤形成。而使用Cdk5的特异性抑制剂Dinaciclib处理，则能够有效逆转谷氨酰胺的这些促癌效应，显著抑制肿瘤生长。

本研究主要应用了以下关键技术方法：利用短发夹RNA（shRNA）构建Cdk5稳定敲低的结直肠癌细胞系；通过MTT法、克隆形成实验、划痕愈合实验和Transwell实验评估细胞增殖、迁移和侵袭能力；采用流式细胞术分析细胞周期、活性氧（ROS）水平和线粒体膜电位；通过蛋白质印迹（Western Blot）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）、免疫荧光、RT-qPCR和CUT&RUN-qPCR等技术分析蛋白表达、相互作用及表观遗传修饰；使用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）进行靶向代谢组学分析；并借助16S rDNA测序分析小鼠肠道菌群组成。

3.1 谷氨酰胺促进结直肠癌细胞的增殖和克隆形成

研究人员用不同浓度的谷氨酰胺处理SW480和DLD-1细胞，发现谷氨酰胺能显著促进细胞增殖和克隆形成能力，且2 mmol/L的浓度效果最为显著。

3.2 Cdk5敲低抑制谷氨酰胺对结直肠细胞的促增殖能力

通过构建Cdk5稳定敲低的细胞系，研究发现敲低Cdk5后，谷氨酰胺对细胞增殖和克隆形成的促进作用被显著削弱。

3.3 Cdk5敲低抑制谷氨酰胺促进细胞周期进程的能力

流式细胞术分析显示，谷氨酰胺处理能促进对照细胞的细胞周期进程（G0/G1期细胞减少，S+G2/M期细胞增加），而Cdk5敲低则抑制了谷氨酰胺的这一效应。

3.4 Cdk5敲低抑制谷氨酰胺促进结直肠癌细胞迁移的能力

划痕实验和Transwell实验结果表明，谷氨酰胺能增强结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力，而Cdk5敲低则显著降低了细胞的迁移和侵袭潜力。

3.5 Cdk5敲低抑制谷氨酰胺对IL-6/STAT3和Wnt/β-Catenin通路的激活

蛋白质印迹和免疫荧光分析发现，谷氨酰胺处理能激活IL-6/STAT3和Wnt/β-Catenin信号通路，表现为β-连环蛋白（β-Catenin）、磷酸化STAT3（P-STAT3）、GLS1、IL-6、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和C-MYC等蛋白表达上调以及β-Catenin的核转位。而Cdk5敲低则抑制了这些通路蛋白的激活。

3.6-3.10 体内实验验证谷氨酰胺的促癌作用及Dinaciclib的抑制效果

在AOM/DSS诱导的小鼠结直肠癌模型中，谷氨酰胺灌胃加重了小鼠的体重减轻、直肠出血和肠道肿瘤负荷，同时加剧了肠道炎症、破坏了肠道屏障完整性并导致肠道菌群失调。而Cdk5抑制剂Dinaciclib的治疗则能有效缓解这些病理变化，抑制肿瘤生长。

3.11 Cdk5敲低上调谷氨酰胺转运蛋白（ASCT2）和谷氨酰胺酶（GLS1）的表达

令人意外的是，蛋白质印迹分析显示，Cdk5敲低后，谷氨酰胺转运蛋白ASCT2和关键酶GLS1的蛋白表达水平反而上调，但GLS1的底物谷氨酸脱氢酶1（GLUD1）的表达无显著变化。

3.12 Cdk5敲低通过EZH2间接调控谷氨酰胺酶GLS1的表达

机制探索表明，Cdk5敲低会导致EZH2蛋白水平下降。通过siRNA敲低EZH2可上调GLS1的表达。免疫共沉淀实验证实Cdk5与EZH2存在相互作用，且EZH2也与GLS1相互作用。CUT&RUN-qPCR进一步证实，EZH2通过催化GLS1启动子区域的H3K27me³修饰来抑制其转录。因此，Cdk5通过调控EZH2的稳定性或活性，间接负调控GLS1的表达。

3.13-3.15 Cdk5敲低通过抑制线粒体功能和TCA循环影响谷氨酰胺的利用

尽管GLS1表达上调，但Cdk5敲低细胞的ATP产量却降低。JC-1和Mito-Tracker染色表明其线粒体膜电位和功能受损。代谢组学分析显示，Cdk5敲低细胞内TCA循环中间代谢物（如柠檬酸、异柠檬酸、富马酸、苹果酸）含量显著下降，而谷氨酸含量上升。这表明Cdk5敲低虽然增强了谷氨酰胺的分解（谷氨酰胺→谷氨酸），但抑制了其后续进入TCA循环的代谢流，导致能量生成障碍。

综上所述，本研究系统阐明了Cdk5在结直肠癌谷氨酰胺代谢中的关键调控作用。研究首次揭示了Cdk5-EZH2-GLS1这条新颖的信号轴：Cdk5通过磷酸化EZH2，增强其介导的H3K27me³修饰，从而抑制GLS1的转录表达。这种表观遗传调控最终影响了线粒体的谷氨酰胺代谢和TCA循环功能，调控癌细胞的能量代谢和增殖。同时，体内实验证实了靶向Cdk5（如使用Dinaciclib）在抑制谷氨酰胺驱动的结直肠癌进展中的治疗潜力。该研究不仅深化了对结直肠癌代谢重编程机制的理解，而且为开发针对Cdk5-EZH2轴或谷氨酰胺代谢的结直肠癌靶向治疗策略提供了重要的理论依据和实验证据。