通过高通量筛选和化学修饰发现并优化RNA编辑引导因子

《ChemBioChem》：Discovery and Tuning of RNA Editing Guides via High-Throughput Screening and Chemical Modification

腺苷脱氨酶ADAR2通过EMERGe平台筛选出靶向雷特综合征中MeCP2提前终止密码子的非典型GUG环引导RNA，经结构活性关系研究和化学修饰优化（2'-O-甲基、2'-氟、磷酸硫酯键），获得兼具体外活性与细胞内稳定性的全修饰引导RNA，证实EMERGe在RNA编辑引导RNA设计中的应用价值。

　　

摘要

作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADAR）能够催化双链RNA中腺苷脱氨生成肌苷。由于在翻译过程中肌苷被读取为鸟苷，这一过程使得在转录本水平上实现可编程的A到G的重新编码成为可能。通过使用引导RNA进行靶向RNA编辑，ADAR可以被用于治疗致病性突变。为了扩展能够进行编辑的引导RNA的设计空间，我们应用了高通量筛选平台EMERGe来识别与Rett综合征相关的MeCP2转录本中早终止密码子相关的序列基序。这一研究发现了一种能够在体外高效被ADAR2介导编辑的引导RNA基序，该基序具有5′-GUG-3′序列，该序列能够形成不对称环结构。为了实现治疗应用，我们进行了结构-活性关系研究和化学优化，最终得到了一种经过完全修饰的引导RNA，其2′端含有O-甲基、氟基团和硫磷酸酯连接基团。这种修饰后的引导RNA保持了未修饰RNA的活性，并表现出更强的核酸酶抗性。在HEK293T细胞中的报告基因实验中，这种优化后的引导RNA能够在两个MECP2位点诱导剂量依赖性的编辑，证明了通过靶向化学修饰可以使EMERGe筛选出的基序在细胞中发挥作用。这些发现突显了EMERGe作为发现工具的实用性，并建立了一种超越传统设计规则来识别和优化引导RNA特性的方法。

图形摘要

一个高通量筛选平台（EMERGe）发现了一种以GUG为中心的非典型环结构，该结构能够在原本难以编辑的5′GA位点支持ADAR2介导的RNA编辑。通过系统的结构-活性研究和针对特定基序的化学优化，我们开发出了一种在体外和细胞内均能保持活性的完全稳定的引导RNA，从而建立了一种引导RNA发现和设计的流程。

利益冲突

P.A.B是ProQR Therapeutics公司的合作者、顾问及股东，该公司致力于开发能够招募ADAR进行定向RNA编辑的寡核苷酸疗法。

数据可用性声明

本研究的支持数据可在本文的补充信息中找到。