P4HA1/HIF1α反馈环路调控肺动脉高压内皮功能障碍的新机制

《Respiratory Research》：The P4HA1/HIF1α feedback loop modulates endothelial dysfunction in pulmonary hypertension

本研究针对肺动脉高压（PH）中内皮细胞功能障碍的代谢机制，发现缺氧诱导的P4HA1通过调控HIF1α稳定性形成正反馈环路，促进内皮细胞糖酵解重编程和血管重塑。研究人员通过体内外实验证实靶向P4HA1可有效缓解PH病理进程，为PH治疗提供了新的代谢干预靶点。

　　

在肺部血管疾病领域，肺动脉高压（Pulmonary Hypertension, PH）一直是个棘手的难题。这种疾病以肺动脉压力异常升高为主要特征，最终会导致右心衰竭，严重威胁患者生命。尽管医学界对PH的认识不断深入，但其发病机制仍有许多未解之谜，特别是内皮细胞在疾病发生发展中的具体作用机制亟待阐明。

近年来，科学家们发现代谢异常在PH发病中扮演着关键角色。类似于肿瘤细胞的"瓦博格效应"，肺动脉内皮细胞在PH状态下也会出现糖酵解增强而氧化磷酸化减弱的代谢重编程现象。这种代谢转变为细胞快速增殖和迁移提供了能量基础，但其中的具体调控机制尚不明确。

南京医科大学附属南京第一医院心血管内科陈绍良教授团队在《Respiratory Research》上发表的最新研究，为我们揭示了这一过程的新机制。研究人员将目光投向了一个名为P4HA1（脯氨酰4-羟化酶亚基α1）的蛋白质，该蛋白在胶原合成中已知作用，但其在PH中的功能尚未被探索。

研究团队运用了多种关键技术方法：通过RNA测序（RNA-seq）筛选缺氧处理的人肺动脉内皮细胞（HPAECs）中的差异表达基因；利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE169471、CRA006636）进行细胞亚群分析；采用数据非依赖性采集（DIA）定量蛋白质组学分析蛋白表达变化；通过染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因实验验证转录调控关系；使用腺相关病毒AAV9载体实现内皮细胞特异性基因敲低；通过海马分析仪检测细胞糖酵解功能（ECAR）。

研究结果从多个层面揭示了P4HA1在PH中的重要作用：

P4HA1在缺氧HPAECs中表达上调

研究人员首先对常氧和缺氧条件下培养的HPAECs进行RNA-seq分析，发现缺氧处理24小时后共有3074个基因表达发生显著变化，其中1700个基因上调，1374个下调。通路富集分析显示，代谢通路相关基因变化最为显著，而P4HA1是其中上调最明显的基因之一。这一发现在多个独立数据集（GSE163827、GSE160255）和单细胞测序数据中均得到验证。体外实验证实，缺氧处理显著提高了HPAECs中P4HA1的mRNA和蛋白水平。更重要的是，在SU5416联合慢性缺氧诱导的PH小鼠模型中，肺血管内皮细胞的P4HA1蛋白表达也明显增加。

P4HA1参与肺动脉高压的调控

为了验证P4HA1在PH中的功能，研究团队构建了内皮细胞特异性敲低P4HA1的AAV9-shP4HA1病毒载体，通过尾静脉注射给PH模型小鼠。实验结果显示，P4HA1敲低部分缓解了SU5416+缺氧引起的三尖瓣环收缩期位移（TAPSE）和肺动脉加速时间/射血时间（PAT/PET）比的下降，同时逆转了右心室收缩压（RVSP）和右心室肥厚指数的升高。组织病理学分析进一步表明，P4HA1敲低显著减轻了肺血管重塑。

P4HA1调控HPAECs功能障碍

研究人员设计了三条靶向P4HA1的小干扰RNA（siRNA），并验证了其敲低效率。将转染si-P4HA1的HPAECs在缺氧条件下培养后进行转录组和蛋白质组分析，结合单细胞测序数据的Scissor算法分析，发现P4HA1敲低主要影响控制组的HPAECs亚群。蛋白质组学GSEA分析显示，P4HA1与氧化磷酸化、三羧酸循环、糖酵解、细胞周期调控等多个生物学过程密切相关。

P4HA1敲低改变缺氧诱导的HPAECs糖酵解和增殖特征

功能实验表明，P4HA1敲低显著抑制了缺氧诱导的HPAECs糖酵解活性增强。流式细胞术分析显示，P4HA1沉默阻碍了细胞周期G1期向S期的转换。EdU染色实验证实P4HA1敲低减少了缺氧诱导的内皮细胞增殖。Transwell迁移实验进一步证明，P4HA1沉默显著抑制了HPAECs的迁移能力。

HIF1α依赖性转录激活P4HA1在HPAECs中的表达

为探究P4HA1上调机制，研究人员通过生物信息学预测并实验验证了HIF1α作为P4HA1上游转录调控因子。RNA-seq数据的转录因子活性推断分析和GSEA均显示HIF1α信号通路在缺氧条件下显著激活。Western blot证实HIF1α和P4HA1在缺氧HPAECs中同步上调，而HIF1α敲低则降低了P4HA1表达。JASPAR数据库预测、ChIP-PCR和双荧光素酶报告基因实验共同证实HIF1α直接结合P4HA1启动子并促进其转录。

P4HA1通过减少泛素化稳定HIF1α蛋白水平

有趣的是，研究发现了P4HA1与HIF1α之间的双向调控关系。蛋白质组学GSEA显示P4HA1敲低抑制了HIF1信号通路。虽然P4HA1敲低降低了HIF1α蛋白水平，但不影响其mRNA表达。Co-IP实验证明P4HA1缺陷增强了HIF1α与泛素之间的相互作用，而蛋白酶体抑制剂MG132处理进一步支持了P4HA1通过调控泛素化影响HIF1α稳定性的假设。

P4HA1通过调控α-KG/琥珀酸轴调节HIF1α羟化

深入研究机制发现，P4HA1敲低影响了2-氧代羧酸代谢和蛋白质羟化通路。HIF1α的脯氨酸402和564位点的羟化是其被pVHL E3泛素连接酶识别并降解的关键步骤。实验表明，α-酮戊二酸（α-KG）处理进一步降低了P4HA1敲低细胞中的HIF1α水平，而琥珀酸处理则增加了HIF1α表达。羟化HIF1α（Pro564）的检测证实P4HA1通过调控α-KG/琥珀酸平衡影响HIF1α羟化状态。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次揭示了P4HA1/HIF1α反馈环路在PH内皮功能障碍中的核心作用。缺氧通过HIF1α转录激活P4HA1表达，而P4HA1又通过调控α-KG/琥珀酸代谢轴影响HIF1α羟化和稳定性，形成自我放大的正反馈循环。这一环路驱动内皮细胞糖酵解重编程、增殖和迁移，促进肺血管重塑。与肺动脉平滑肌细胞中已知的代谢调控因子PFKFB3不同，P4HA1代表了一种新的内皮特异性代谢检查点。

该研究的创新性在于将胶原修饰酶P4HA1与缺氧信号和代谢重编程联系起来，突破了传统上对该酶功能的认知。发现的P4HA1/HIF1α反馈环路为理解PH发病机制提供了新视角，提示靶向这一轴心可能成为PH治疗的新策略。特别是考虑到P4HA1作为代谢酶的可靶向性，这一发现具有重要的转化医学价值。

研究也存在一定局限性，如主要聚焦于内皮细胞，未来需要进一步探讨P4HA1在其他PH相关细胞类型中的作用；临床样本验证不足，需要更多人类PH组织数据支持；具体的α-KG/琥珀酸代谢流变化机制有待深入解析。

总之，这项研究不仅深化了对PH代谢机制的理解，也为开发新的治疗策略提供了潜在靶点。通过打破P4HA1/HIF1α恶性循环，可能为逆转肺血管重塑、改善PH预后开辟新的途径。