蛋白质纳米颗粒在植物体内聚集，展示具有抗原性的病毒肽，并引发针对特定表位的免疫反应

《The FEBS Journal》：Protein nanoparticles assemble in plants, display antigenic viral peptides, and produce an epitope-specific immune response

纳米颗粒疫苗通过植物表达系统成功设计并表达，融合M和GP5蛋白的epitope与AaLSm形成稳定结构并高效糖基化，小鼠免疫试验显示两者均诱导特异性抗体，但AMG存在非特异免疫反应。

　　这项研究围绕一种名为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病毒性疾病展开，探讨了一种基于蛋白纳米颗粒的植物表达疫苗的可行性。PRRS对全球养猪业造成了严重威胁，导致猪只出现咳嗽、打喷嚏、肺炎、生长受阻以及母猪妊娠并发症等问题。此外，该病还会引发继发性细菌感染，如支气管炎支原体，从而加剧抗菌药物的使用问题，进而推动了对更安全有效的疫苗研发需求。

研究团队设计了一种融合了两种PRRS病毒蛋白M和GP5部分的表位，与来自超嗜热菌 *Aquifex aeolicus* 的一种名为AaLS的酶——光黄素合成酶进行基因融合，从而构建了一种新型的纳米颗粒疫苗。这种融合蛋白在转基因植物 *Nicotiana benthamiana* 的叶片中实现了较高的可溶性表达，达到了每克新鲜植物组织约0.18毫克的水平。这种纳米颗粒结构能够有效地展示PRRS的抗原表位，并且在植物表达系统中表现出良好的糖基化特性，即在N端添加了寡聚甘露糖的N连接糖基。为了进一步验证这种纳米颗粒疫苗的免疫原性，研究团队还与另一种基于烟草花叶病毒（TMV）衣壳蛋白的疫苗候选物进行了对比实验，发现两者均能诱导针对PRRS表位的特异性抗体反应。这一成果为未来在猪身上评估这种疫苗的有效性奠定了基础。

PRRSV是一种小的、包膜的RNA病毒，属于 *Nidovirales* 秩序和 *Arteriviridae* 家族。它被分为两种主要类型：PRRSV-1和PRRSV-2，后者的基因序列与前者平均有65%的相似性。虽然已有多种疫苗用于PRRS的防控，包括减毒活疫苗和灭活疫苗，但它们在交叉保护效果或安全性方面存在局限。因此，开发一种更安全、更有效的疫苗成为当务之急。

M和GP5是PRRSV包膜中最丰富的两种蛋白，它们通过N端的二硫键相互作用。GP5和M在病毒的形成和出胞过程中发挥关键作用，并且在细胞附着和进入过程中也至关重要。其中，GP5中的某些中和抗体结合位点在控制感染方面表现出较高的效果，而M蛋白则不包含中和表位。然而，将M和GP5共同表达可以增强对GP5的免疫反应。因此，这种蛋白组合为疫苗设计提供了重要的参考。

蛋白纳米颗粒是一种新兴的疫苗设计工具，它们由单体自组装成稳定的四级结构。有些纳米颗粒基于病毒衣壳蛋白，如病毒样颗粒（VLPs），而另一些则来源于细菌，形成较小的笼状结构。无论其来源如何，这些纳米颗粒都具有在疫苗设计中作为抗原展示支架的潜力。它们的较大尺寸有助于与免疫系统更有效地相互作用，而抗原的重复展示则增强了免疫细胞对这些抗原的识别能力。这种特性使得纳米颗粒疫苗相较于单体抗原更具优势。

研究团队关注的蛋白纳米颗粒之一是来自 *Aquifex aeolicus* 的AaLS。这种细菌生活在海底热泉附近，其AaLS蛋白具有高度的热稳定性，能够在约120°C的温度下保持结构完整性。这种特性对于后续的生物制药处理具有重要意义。此外，AaLS能够自组装成一个由60个亚基组成的空心球状结构，其外部直径约为15.4纳米。由于这种较大的结构尺寸，AaLS可能比其他较小的纳米颗粒更有利于免疫系统的识别和激活。

植物作为生产重组蛋白的一种新兴平台，具有许多优势，如灵活性、快速性、可扩展性和成本效益。与哺乳动物细胞系统相比，植物系统不受哺乳动物病原体的干扰，且能够进行一些重要的后翻译修饰，如糖基化和二硫键形成，这对某些蛋白的折叠、稳定性和免疫原性至关重要。此外，植物表达系统还能有效避免病原体污染，这在疫苗生产中尤为重要。

在本研究中，团队首次在植物中成功表达了AaLS和其修饰形式AaLSm。其中，AaLSm是通过将N102位点的天冬酰胺替换为谷氨酰胺，从而避免糖基化的一种变体。这种设计有助于研究糖基化对蛋白折叠和免疫原性的影响。研究结果显示，AaLSm在植物叶片中表现出较高的可溶性表达水平，接近0.2毫克每克新鲜植物组织。同时，将PRRSV的M-GP5表位与AaLSm融合并未对蛋白的积累水平造成显著影响，表明这种融合策略在植物表达系统中是可行的。

为了进一步研究这些纳米颗粒是否能够有效展示PRRSV的抗原表位，研究团队对AaLSm和AMG（AaLSm-M-GP5融合蛋白）进行了纯化和分析。使用IMAC方法进行纯化后，通过尺寸排阻色谱（SEC）分离出组装好的纳米颗粒。电子显微镜（TEM）的结果显示，这些纳米颗粒能够形成预期的15.4纳米直径的球状结构，证实了其在植物表达中的成功组装。此外，通过免疫金定位技术，团队进一步确认了M-GP5表位在纳米颗粒表面的展示情况，从而验证了其可能的免疫原性。

糖基化是影响蛋白功能和免疫原性的重要因素之一。在本研究中，通过PNGase F酶处理，团队发现AaLSm并未发生糖基化，而AMG则表现出明显的糖基化现象，说明该融合蛋白在植物中能够有效地进行糖基化。进一步的质谱分析表明，AMG和TMG（TMVc-M-GP5融合蛋白）在GP5表位上主要携带寡聚甘露糖N连接糖基，而非复杂的Golgi糖基。这种糖基化模式通常与内质网（ER）中的蛋白有关，表明这些纳米颗粒可能在分泌过程中未经历Golgi的进一步糖基化处理。

在免疫学研究方面，团队通过小鼠免疫试验评估了这两种疫苗候选物的免疫原性。小鼠分别接受了AMG和TMG两种疫苗，以及作为阴性对照的磷酸盐缓冲液（PBS）。结果显示，这两种疫苗都能诱导针对PRRSV表位的特异性抗体反应，且在最终采血时，抗体滴度达到了32,000倍和128,000倍的稀释水平。这表明，经过三剂接种后，这些疫苗能够有效激活小鼠的免疫系统。相比之下，控制组的小鼠在整个实验过程中没有表现出明显的免疫反应。

值得注意的是，TMG的免疫反应主要针对PRRSV的表位，而AMG则表现出对纳米颗粒支架的免疫反应。这表明，AaLSm本身具有一定的免疫原性，可能在诱导抗体反应方面发挥了重要作用。相比之下，TMVc作为支架并未引发针对自身的免疫反应，这表明其作为疫苗载体具有良好的安全性。这些发现为未来的疫苗开发提供了重要的参考，特别是在选择合适的纳米颗粒支架方面。

在评估这些疫苗的潜在应用时，团队指出，植物生产的疫苗具有显著的经济优势。与传统的人类疫苗相比，植物生产的疫苗可以以更低的成本制造，且无需复杂的下游处理和纯化步骤。此外，这些疫苗可以通过口服方式给予动物，从而避免注射带来的不便和成本。口服疫苗能够直接刺激黏膜免疫系统，这在PRRSV的传播途径中尤为重要，因为该病毒主要通过呼吸道和生殖道传播。因此，诱导这些部位的IgA抗体可能比全身性的IgG抗体更具实际应用价值。

此外，团队还关注了性别对免疫反应的影响。考虑到许多动物的免疫功能在性别上存在差异，尤其是女性通常表现出更强的适应性和体液免疫反应，团队在实验中同时纳入了雄性和雌性小鼠。结果显示，两种疫苗在雄性和雌性小鼠中的免疫反应没有显著差异，尽管雌性小鼠的抗体滴度略高。这表明，这些疫苗在不同性别个体中可能具有相似的免疫效果。

总的来说，这项研究展示了基于蛋白纳米颗粒的疫苗在植物表达系统中的可行性。AaLS和AaLSm这两种纳米颗粒不仅能够在植物中成功表达，还能够有效展示PRRSV的抗原表位，并且在免疫反应方面表现出良好的效果。这些发现为未来开发针对PRRS的更安全、更有效的疫苗提供了理论依据和技术基础。同时，研究团队还提出了进一步优化这些疫苗的可能方向，如调整抗原表位序列、尝试不同的佐剂以及探索糖基化工程策略等。这些研究为植物表达平台在疫苗开发中的应用提供了新的思路和方法。