对串联VHH（Engineering tandem VHHs）进行工程改造，使其能够靶向不同的表位，从而增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）

《FEBS Open Bio》：Engineering tandem VHHs to target different epitopes to enhance antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity

工程化双特异性抗体中单域抗体臂的构象优化可显著增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性，其机制与EGFR分子间的协同结合及Fc域的有序排列相关。

　　在现代生物医学研究中，抗体工程已成为一种重要的工具，用于开发针对特定疾病的高效治疗策略。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）作为免疫系统的一种关键防御机制，具有显著的临床应用潜力。通过设计和优化抗体的结构，科学家能够增强其对靶细胞的识别能力，同时提高其激活免疫效应细胞的效率。本文探讨了如何利用单域VHH（可变重链结构域）构建双特异性抗体（BsAb）以增强ADCC效应，特别是针对表皮生长因子受体（EGFR）的靶向治疗。EGFR是一种在多种癌症中高度表达的受体蛋白，其异常表达或突变与肿瘤的生长、转移及预后密切相关，因此开发高效的抗EGFR抗体具有重要的临床意义。

### 抗体工程与ADCC机制

ADCC是一种由抗体介导的免疫反应，其中效应细胞（如自然杀伤细胞NK细胞）通过识别抗体的Fc结构域，从而攻击表达特定抗原的靶细胞。这一过程涉及多个步骤，包括抗体与靶细胞表面抗原的结合、Fc结构域在靶细胞表面的聚集、效应细胞通过Fcγ受体（FcγR）与Fc结构域的相互作用，以及效应细胞释放细胞毒性分子以破坏靶细胞。ADCC在多种癌症治疗中发挥着重要作用，如西妥昔单抗（cetuximab）、达雷妥尤单抗（daratumumab）、曲妥珠单抗（trastuzumab）和利妥昔单抗（rituximab）等。

然而，传统的单克隆抗体（mAb）在治疗中存在一定的局限性，例如获得性耐药性和剂量限制性毒性，这些因素可能影响治疗效果并限制其长期应用。为了解决这些问题，研究者开始探索双特异性抗体的设计策略，以增强其对靶细胞的识别和激活能力。双特异性抗体通过同时结合两个不同的抗原表位，不仅可以提高对靶细胞的结合亲和力，还可能增强抗体的多价性和结合强度，从而提升ADCC的效率。

在本文中，研究者采用了一种基于VHH结构域的双特异性抗体设计方法，将两种不同的抗EGFR纳米抗体（7D12和EGA1）与人类IgG1的Fc结构域结合，形成不同的抗体格式，包括单价、双价和串联结构。这种设计方法利用了VHH结构域的高特异性、小体积和可溶性等特性，使抗体在体内的稳定性和药代动力学表现优于传统抗体。此外，研究还发现，当两种不同的VHH结构域被串联在一起时，它们能够同时结合不同的EGFR分子，从而实现更高效的受体聚集，进一步增强ADCC反应。

### 抗体结构与功能的关系

为了进一步研究这些抗体的结合模式和ADCC效应，研究者通过生物层干涉技术（BLI）和流式细胞术评估了抗体与靶细胞的结合能力。结果显示，双价抗体（如E-1和E-2）在结合亲和力方面优于单价抗体（如E-1/N和E-2/N），但这种优势并不总是直接转化为更强的ADCC活性。例如，在某些细胞系中，单价抗体E-1/N虽然结合能力较弱，却表现出更高的ADCC信号，这可能与抗体在细胞表面的呈现方式和结合方式有关。

研究者进一步比较了串联格式的双特异性抗体E-12/N与单价和双价抗体的ADCC活性。结果显示，E-12/N在多种癌细胞系中表现出显著增强的ADCC效应，且其ADCC活性并未因结合能力的提升而受到明显影响。这表明，除了抗体的结合能力外，抗体的结合模式、空间排列和与FcγR的相互作用可能在ADCC过程中发挥关键作用。

### 抗体结合模式的结构分析

为了揭示这些抗体如何增强ADCC效应，研究者通过结构建模分析了它们与EGFR的结合模式。基于晶体结构和AlphaFold预测的结构信息，研究者发现7D12和EGA1在E-12/N中倾向于结合不同的EGFR分子，而非同一分子。这种结合模式能够促进EGFR的聚集，进而增强Fc结构域在细胞表面的密集呈现，从而提高NK细胞与抗体的相互作用效率。此外，研究者还提出了一种新的结合模式，即E-12/N能够桥接多个EGFR分子，形成更高阶的复合体，这种结构可能进一步增强效应细胞的激活和杀伤能力。

这种结构上的优化不仅有助于提高ADCC活性，还可能为抗体工程提供新的思路。例如，通过调整VHH结构域的连接方式、优化抗体的构型和空间排列，可以实现更高效的靶向结合和效应细胞激活。此外，这种设计还可能减少抗体的免疫原性，提高其在体内的稳定性，并降低生产成本，从而为临床应用提供更经济可行的方案。

### ADCC活性的优化策略

本文的研究结果表明，双特异性抗体在某些情况下能够显著增强ADCC活性，即使其结合能力并未显著优于单价抗体。这提示我们，抗体的ADCC活性不仅取决于其结合能力，还可能受到其结合方式、Fc结构域的空间排列以及效应细胞的激活效率等因素的影响。因此，在抗体设计过程中，需要综合考虑这些因素，以实现最佳的治疗效果。

此外，研究者还发现，某些双价抗体在结合能力上虽不如单价抗体，但其ADCC活性却更高。这可能是因为双价抗体在细胞表面的呈现方式更有利于效应细胞的激活，从而在ADCC过程中发挥更大的作用。例如，双价抗体E-1在多种细胞系中表现出更强的ADCC信号，这可能与其能够同时结合两个EGFR分子并促进FcγR的聚集有关。

值得注意的是，E-12/N抗体在所有测试的细胞系中均表现出最优的ADCC活性。这表明，将两个不同的抗EGFR结构域串联在一起，不仅能够提高结合亲和力，还能够通过促进EGFR的聚集和Fc结构域的密集呈现，增强效应细胞的激活效率。因此，这种设计策略可能为未来的抗体工程提供重要的参考。

### 临床应用与未来展望

EGFR作为多种癌症的重要靶点，其表达水平和突变状态直接影响抗EGFR抗体的治疗效果。目前，已有多种抗EGFR抗体被用于临床治疗，如西妥昔单抗和帕尼单抗。然而，这些抗体在某些情况下可能面临耐药性和毒性等问题，限制了其长期应用。因此，开发具有更高ADCC活性的抗EGFR抗体，可能是提高治疗效果和延长患者生存期的关键。

本文的研究结果表明，通过合理设计抗体的结构，特别是利用VHH结构域的特性，可以有效提高ADCC活性。这不仅有助于克服传统抗体的局限性，还可能为其他靶点的抗体开发提供新的思路。例如，类似的双特异性设计可以应用于其他受体或抗原，以增强免疫效应细胞的激活效率。

此外，研究还指出，利用结构建模和生物信息学工具可以更深入地理解抗体与受体之间的相互作用机制。这种跨学科的研究方法有助于优化抗体设计，提高其在体内的稳定性和药代动力学特性，从而为临床应用提供更可靠的治疗方案。

总之，本文通过系统的研究和实验，揭示了双特异性抗体在增强ADCC活性方面的潜力。通过结合不同的VHH结构域，并优化其在细胞表面的结合模式和空间排列，研究者成功地提高了抗体的治疗效果。这一成果不仅为抗EGFR抗体的开发提供了新的策略，也为其他抗体工程研究提供了重要的参考。未来，随着更多相关研究的开展，这种设计方法有望在多种癌症治疗中发挥更大的作用。