c-Abl激酶通过调控ZO-2蛋白来影响细胞迁移和形态变化

《The FASEB Journal》：c-Abl Kinase Targets Tight Junction Protein ZO-2 in Regulation of Cell Migration and Morphology

细胞形态与迁移的调控机制：c-Abl通过磷酸化ZO-2抑制细胞迁移和力学特性

　　c-Abl是一种非受体酪氨酸激酶，它在细胞迁移和形态发生中发挥重要作用。尽管其在肿瘤转化和核信号传导中的角色已经被广泛研究，但其在细胞质中的功能，尤其是在细胞骨架调节和细胞迁移中的具体机制仍不明确。本研究旨在揭示c-Abl如何通过其靶蛋白ZO-2调控细胞迁移和形态变化。通过RNAi介导的敲低和恢复策略，我们发现c-Abl直接结合并磷酸化ZO-2的C端，同时刺激JAK1的活性，JAK1随后磷酸化ZO-2的N端。这些磷酸化事件会削弱细胞骨架的收缩性，降低细胞对基质的牵引力，从而抑制细胞迁移。这些发现表明ZO-2是c-Abl调控细胞迁移的新介质。

细胞迁移是发育、免疫反应和组织稳态中的关键过程。虽然c-Abl最著名的功能与肿瘤转化和核信号传导相关，但越来越多的证据表明其在细胞质中也参与细胞骨架的调控，进而影响迁移。c-Abl参与多种细胞过程，包括形态发生、增殖、存活和中枢神经系统发育。在细胞质中，c-Abl通过与F-actin和G-actin相互作用来调控细胞迁移和形态变化。在细胞扩展的早期阶段，整合素会刺激c-Abl的激酶活性，这种活性随后与粘附斑蛋白相互作用，并磷酸化细胞骨架调控蛋白。通过这些磷酸化事件，c-Abl可以间接影响单细胞迁移和集体迁移。这些观察结果表明，c-Abl能够调节与细胞运动相关的细胞动态，尽管其通过细胞骨架重塑的具体下游效应器仍不完全明确。

在正常细胞中，c-Abl的催化活性受到严格调控，这是其参与多种信号反应的关键组成部分。c-Abl能够在细胞核和细胞质之间穿梭，这种穿梭由三个核定位信号和一个核输出信号介导。c-Abl在不同亚细胞定位中表现出不同的功能：核中的c-Abl与G1期细胞周期阻滞、DNA损伤反应、细胞凋亡、DNA修复和RNA聚合酶II激活相关。相比之下，c-Abl在细胞质中的功能仍知之甚少。c-Abl激酶活性的异常已被与多种病理结果相关，包括慢性髓系白血病（CML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）以及神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病。c-Abl在小鼠中的敲除会导致胚胎或出生后死亡、形态异常、T和B细胞淋巴细胞减少以及心脏异常。除了这些功能外，c-Abl还被认为影响细胞形状变化和形态发生程序，无论是在发育还是疾病背景下。这些发现强调了c-Abl在生理和病理中的广泛意义，同时也指出了其在细胞骨架调节和细胞迁移中的细胞质功能仍有待研究。

紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2和ZO-3是磷酸化蛋白，属于MAGUK家族。ZO蛋白是多结构域的支架蛋白，它们在紧密连接区域募集多种分子。ZO-2功能的失调与家族性高胆汁酸血症、非综合征性进行性听力损失以及多种上皮癌（如乳腺癌、睾丸癌和胰腺导管腺癌）有关。ZO蛋白的丢失或突变会导致细胞极性破坏和组织结构异常。有研究指出，ZO蛋白含有多个相互作用域（PDZ、SH3和鸟苷酸激酶样结构域），它们组织连接复合物并将其与肌动蛋白细胞骨架连接。其中，ZO-2不仅在维持细胞间屏障功能和上皮极性中发挥作用，还通过直接和间接与F-actin和连接成分的相互作用参与核信号传导和细胞骨架结构调控。此外，ZO-2还对组织流动性及协调迁移有影响；其翻译后修饰，包括酪氨酸磷酸化，会改变连接相互作用和细胞与细胞外基质之间的机械耦合。

最近的研究表明，ZO-2表达或磷酸化状态的变化会影响集体迁移和连接可塑性，从而建立紧密连接重塑与组织形态发生的潜在机制联系。这些发现表明，ZO-2不仅仅是连接结构的组成部分，它还是细胞骨架动态和多细胞协调的活跃调节者。重要的是，这些作用与c-Abl对细胞骨架的影响相似，这提示了这两个分子之间可能存在功能上的相互作用。

因此，c-Abl和ZO-2都被单独与细胞骨架动态和细胞连接调节联系起来，但它们之间是否存在直接的调控关系尚未被探索。在本研究中，我们鉴定出ZO-2是c-Abl的新底物。通过多种证据，我们展示了c-Abl介导的ZO-2磷酸化在调控细胞形态和迁移中的关键作用。我们相信这些发现将有助于加深对c-Abl细胞质功能的理解，并揭示其在细胞运动和形态发生中的重要作用。此外，通过结合可诱导的c-Abl激活、ZO-2磷酸化位点的生化映射以及牵引力和单层张力的定量分析，我们证明了ZO-2作为连接c-Abl活性与细胞骨架组织和集体细胞力学的关键介质，从而将连接信号传导与组织层面的行为（如迁移和形态发生）整合起来。

本研究采用了多种实验方法来验证ZO-2作为c-Abl底物的功能。其中包括细胞培养、转染、c-Abl激活、CRISPR/Cas9技术生成ZO-2敲除细胞系、免疫沉淀和Western blot分析、结合实验和体内激酶实验、体外激酶实验、位点特异性突变、定量实时PCR、免疫荧光成像分析以及牵引力显微镜和单层应力显微镜。通过这些方法，我们能够详细分析c-Abl对ZO-2的结合和磷酸化，以及这种修饰如何影响细胞形态和迁移。

在实验中，我们观察到c-Abl的激酶活性会显著改变细胞形态。通过使用四环素诱导的293细胞系，我们验证了c-Abl的表达和活性。Western blot分析确认了c-Abl的表达，并通过抗酪氨酸抗体检测到其激酶活性。此外，我们还通过免疫沉淀和Western blot分析确定了ZO-2与c-Abl的结合情况。通过生成ZO-2的截断突变体，我们发现c-Abl主要结合ZO-2的C端。在体外激酶实验中，我们进一步验证了c-Abl对ZO-2的磷酸化作用，特别是Y1118位点。通过使用抗磷酸酪氨酸抗体，我们发现Y1118的磷酸化仅在c-Abl活性细胞中出现，而在c-Abl非活性细胞中没有检测到。此外，我们还通过siRNA敲低策略验证了ZO-2在c-Abl介导的形态变化中的作用。结果显示，ZO-2的表达减少会显著削弱c-Abl活性诱导的形态变化，而其他候选蛋白则未表现出类似的效应。这些结果表明，ZO-2是c-Abl调控细胞形态的关键介质。

为了进一步探究c-Abl介导的ZO-2磷酸化对细胞迁移的影响，我们使用了伤口愈合实验。结果显示，c-Abl的激活几乎完全阻止了细胞迁移，而其非活性形式则未影响迁移。通过将ZO-2敲除并与c-Abl激活相结合，我们发现ZO-2的缺失显著削弱了c-Abl对迁移的抑制作用，这表明ZO-2在这一过程中起着重要作用。通过表达不同的磷酸化抵抗突变体，我们发现Y1118的磷酸化在c-Abl依赖的迁移调控中起主要作用，而其他位点则起辅助作用。这些结果进一步支持了ZO-2作为c-Abl调控迁移的关键介质。

通过牵引力显微镜和单层应力显微镜，我们还评估了c-Abl对细胞机械力的影响。结果显示，c-Abl激活显著降低了细胞对基质的牵引力，而ZO-2敲除则削弱了这种降低效果。这些结果表明，ZO-2在c-Abl介导的牵引力降低中起关键作用。同时，我们发现c-Abl激活并未显著改变单层应力，这表明细胞间应力的传输能力仍然保持。然而，牵引力的减少与细胞收缩性的降低相关，这可能通过影响细胞与基质的粘附和细胞骨架结构来实现。通过定量PCR和免疫荧光分析，我们发现c-Abl激活会显著降低肌球蛋白II的表达，这与细胞收缩性的减弱一致。此外，ZO-2的缺失也影响了细胞的基线牵引力，进一步支持了ZO-2在这一过程中的关键作用。

本研究的发现揭示了ZO-2作为c-Abl调控细胞迁移和形态变化的重要介质。c-Abl通过直接和间接磷酸化ZO-2，降低了细胞的牵引力和收缩性，从而抑制迁移。这些结果不仅深化了我们对c-Abl细胞质功能的理解，也为细胞运动和形态发生提供了新的分子机制见解。此外，我们还发现ZO-2的磷酸化可能通过影响其与连接蛋白JAM-A的相互作用，间接调控细胞粘附和迁移。这些机制可能与其他酪氨酸激酶（如c-Src）对ZO-2的磷酸化作用不同，提示了ZO-2磷酸化在不同病理背景下的多样性。

综上所述，本研究确定了ZO-2作为c-Abl调控细胞形态和迁移的关键介质。通过直接和间接磷酸化，c-Abl改变了细胞的机械特性，从而影响迁移能力。这些发现不仅有助于理解c-Abl在细胞骨架调控中的作用，也为相关疾病（如癌症和神经退行性疾病）的治疗提供了新的靶点。未来的研究将进一步探索ZO-2磷酸化在不同细胞环境下的具体作用，以及其与其他信号通路的潜在交互作用，以全面理解其在细胞运动和组织形态发生中的调控机制。