NSUN7介导的circNTRK2 m5C修饰通过激活STK31调控胶质母细胞瘤干细胞特性

《Journal of Translational Medicine》：NSUN7-mediated m5C modification of circNTRK2 regulates stemness properties of glioblastoma cells by activating STK31

为解决胶质母细胞瘤(GBM)中治疗抵抗性干细胞样细胞驱动的复发难题，研究人员开展了NSUN7介导的circNTRK2 m5C修饰调控干细胞特性的机制研究。结果发现该修饰通过YBX3识别、STK31激活及IKZF1磷酸化/O-GlcNAc修饰失衡轴，显著促进GBM干细胞特性，为GBM靶向治疗提供了新型生物标志物和治疗靶点。

　　

胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)作为最具侵袭性的原发性脑肿瘤，其预后极差，患者诊断后的中位生存期仅12-15个月。这种治疗困境很大程度上源于一群具有干细胞特性的肿瘤细胞，它们能够自我更新、分化并驱动肿瘤复发，对常规的化疗和放疗产生抵抗。因此，深入解析GBM干细胞特性的调控机制，对于开发克服治疗抵抗的新策略至关重要。

近年来，RNA表观遗传修饰，特别是N6-甲基腺苷(m6A)修饰，在肿瘤中的作用已被广泛研究。然而，另一种重要的RNA修饰——5-甲基胞嘧啶(m5C)修饰，尤其是在环状RNA(circRNA)上的功能，在GBM中仍知之甚少。环状RNA是一类形成共价闭合环状结构的非编码RNA，其稳定性高，在肿瘤发生发展中扮演着越来越重要的角色。同时，m5C修饰能否像m6A一样，通过特定的“书写器”(writer)和“阅读器”(reader)蛋白，精细调控circRNA的命运和功能，进而影响肿瘤的恶性行为，是一个亟待探索的前沿科学问题。

在此背景下，由赵宇博、张梦阳、马家春等研究人员组成团队，在《Journal of Translational Medicine》上发表了一项研究，揭示了NSUN7介导的circNTRK2 m5C修饰在调控GBM干细胞特性中的关键作用及其分子通路。该研究不仅发现了一个新的m5C修饰位点，还阐明了一条从RNA修饰到激酶激活，再到转录因子功能调控的完整信号轴，为理解GBM的顽固性提供了新视角，并指出了潜在的干预靶点。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。他们利用生物信息学分析了公共数据库(如TCGA和GTEx)中NSUN7、YBX3、STK31、IKZF1等基因的表达与临床关联。研究样本包括人GBM组织标本、非肿瘤脑组织以及从患者分离的原代胶质母细胞瘤细胞(PPDG)和细胞系(如U251)。关键实验技术包括m5C点印迹、m5C-RIP-qPCR、m5C-亚硫酸氢盐测序用于鉴定m5C修饰；RNA Pull-down、RIP、免疫荧光用于验证分子间相互作用；体外激酶实验用于证实STK31的自磷酸化及其对IKZF1的磷酸化；染色质免疫共沉淀(ChIP)和荧光素酶报告基因实验用于分析IKZF1的转录活性；集落形成实验和肿瘤球形成实验用于评估干细胞特性；并通过皮下异位和原位异种移植模型在体内验证了该通路的功能。

NSUN7促进circNTRK2在C158位的m⁵C修饰并调控GBM细胞干细胞特性

研究人员首先发现circNTRK2在GBM细胞系U251和PPDG中低表达。通过m5C点印迹实验，他们发现GBM细胞中总m5C水平高于正常人星形胶质细胞(NHA)。利用RNAm5Cfinder数据库预测，并结合m5C-RIP-qPCR和m5C-Bis-Seq实验，他们成功鉴定出circNTRK2上存在一个关键的m5C修饰位点C158。功能实验表明，过表达野生型circNTRK2能够抑制GBM细胞的自我更新和成球能力，而过表达C158位点突变的circNTRK2(158C-A)则表现出更强的抑制效果，提示m5C修饰削弱了circNTRK2的肿瘤抑制功能。

为了寻找催化这一修饰的“书写器”，研究人员通过RNA Pull-down结合质谱分析，从8个保守的m5C甲基转移酶中筛选出NSUN7与circNTRK2特异性结合。敲低NSUN7后，circNTRK2的m5C修饰水平显著降低。临床样本分析显示，NSUN7在GBM组织和细胞中高表达，且与肿瘤分级正相关。功能上，NSUN7通过促进circNTRK2的m5C修饰来上调干细胞标志物DCLK1和OCT4的表达，从而增强GBM细胞的干细胞特性。挽救实验进一步证实，circNTRK2的m5C修饰是NSUN7发挥促干细胞功能的关键环节。

YBX3结合m⁵C修饰的circNTRK2并降低其稳定性

接下来，研究团队探索了识别m5C修饰的“阅读器”。质谱分析提示YBX3是一个候选分子。RNA Pull-down和RIP实验证实YBX3特异性地结合野生型circNTRK2，而不结合C158A突变体。m5C-Bis-Seq证实了结合复合物中circNTRK2的C158位点被甲基化。免疫荧光显示两者胞质共定位。重要的是，敲低YBX3或circNTRK2本身发生C158A突变，都会缩短circNTRK2的半衰期，但不影响其新生转录，表明YBX3通过识别m5C修饰来促进circNTRK2的降解。与NSUN7类似，YBX3在GBM中高表达且与不良预后相关。功能实验表明，YBX3通过 destabilize circNTRK2来促进干细胞特性，而这一效应同样依赖于circNTRK2的m5C修饰。

STK31在GBM中低表达并抑制干细胞特性

研究的另一条线索聚焦于circNTRK2的下游效应分子。通过数据库分析和RNA Pull-down/MS筛选，研究人员发现丝氨酸/苏氨酸激酶31(STK31)能与circNTRK2结合。与大多数已报道的STK31在癌症中的促癌作用相反，本研究发现STK31在GBM组织和细胞中低表达，且与肿瘤分级负相关。过表达STK31能抑制GBM细胞的干细胞特性，提示其在GBM中扮演抑癌角色。

CircNTRK2通过促进S884位自磷酸化激活STK31

那么，circNTRK2如何调控STK31？研究人员发现circNTRK2和STK31的过表达并不相互影响彼此的蛋白水平。RNAfold数据库预测circNTRK2倾向于形成长于33 bp的双链RNA(dsRNA)结构。RNA Pull-down实验表明，circNTRK2的dsRNA结构通过与STK31的Tudor结构域结合来发挥作用。体外激酶实验显示，野生型circNTRK2能显著促进STK31在S884位的自磷酸化，而缺失Tudor结构域或S884位点突变的STK31则无法被激活。功能挽救实验证明，circNTRK2需要通过激活STK31的激酶活性来抑制GBM干细胞特性。

IKZF1转录激活DCLK1和OCT4以促进干细胞特性

为了解析STK31的下游机制，研究人员通过生物信息学分析，发现转录因子IKAROS家族锌指蛋白1(IKZF1)与干细胞标志物DCLK1和OCT4的表达显著相关。实验证实IKZF1在GBM中高表达，且其过表达促进而敲低抑制干细胞特性。ChIP和荧光素酶报告基因实验证实IKZF1能直接结合到DCLK1和OCT4的启动子区域，正向调控它们的转录。

STK31磷酸化IKZF1的S63位点以抑制其O-GlcNAc化和转录活性

Co-IP和免疫荧光证实STK31与IKZF1存在相互作用。STK31过表达不影响IKZF1的mRNA和蛋白水平。质谱分析和体外激酶实验证实STK31能直接磷酸化IKZF1的第63位丝氨酸(S63)。有趣的是，O-GlcNAc修饰是一种常见的与磷酸化竞争同一丝氨酸/苏氨酸位点的翻译后修饰。预测和实验证实，IKZF1的S63位点也是一个潜在的O-GlcNAc修饰位点。Western blot和荧光素酶实验表明，STK31过表达增强了IKZF1的S63磷酸化，同时降低了其O-GlcNAc化水平，并抑制了IKZF1对DCLK1和OCT4的转录激活能力。相反，敲低STK31或用O-GlcNAc转移酶(OGT)抑制剂处理，能改变这两种修饰的平衡并影响转录活性。这表明STK31通过磷酸化IKZF1的S63位点，竞争性抑制其O-GlcNAc化，从而抑制其转录活性。

联合靶向YBX3/IKZF1和过表达circNTRK2/STK31在体内产生最佳抗肿瘤效果

最后，研究团队利用原位异种移植模型评估了该通路的治疗潜力。他们将携带荧光素酶的U251细胞注射到裸鼠脑内，并分别给予对照、过表达circNTRK2-158C-A、过表达STK31、敲低IKZF1以及同时过表达circNTRK2-158C-A和STK31并敲低IKZF1的处理。活体成像、肿瘤体积测量和生存分析均显示，单一干预已有一定效果，但三管齐下的联合治疗策略能最大程度地抑制肿瘤生长并显著延长小鼠生存期，证明了靶向该通路在治疗GBM方面的巨大潜力。

研究结论与意义

本研究系统性地揭示了一条全新的调控GBM干细胞特性的分子通路：NSUN7作为m5C的“书写器”，催化circNTRK2在C158位点的m5C修饰；YBX3作为“阅读器”识别该修饰并促进circNTRK2的降解；而未被降解的circNTRK2则通过其dsRNA结构结合STK31的Tudor结构域，促进STK31在S884位的自磷酸化并激活其激酶活性；活化的STK31进而磷酸化转录因子IKZF1的S63位点，竞争性抑制其O-GlcNAc化，最终抑制IKZF1对下游干细胞关键基因DCLK1和OCT4的转录激活，从而负调控GBM的干细胞特性。

这项研究的创新性和重要意义在于：首先，它将RNA表观遗传修饰(m5C)、环状RNA和激酶信号通路巧妙地联系起来，揭示了一个从表观转录组到蛋白质磷酸化修饰的跨层次调控网络。其次，它明确了STK31和IKZF1在GBM中与在其他癌症中不同的功能角色，强调了肿瘤信号通路的组织特异性。更重要的是，该研究不仅阐明了机制，还通过体内实验验证了联合靶向该通路多个节点的治疗策略的有效性，为开发针对难治性GBM的联合疗法提供了坚实的理论依据和有前景的候选靶点（如激活STK31或靶向YBX3/IKZF1）。未来，进一步探究IKZF1的O-GlcNAc修饰如何影响其核定位或DNA结合能力，将有助于更深入地理解其调控干细胞特性的精细机制。尽管将这些发现转化为临床应用仍面临诸如血脑屏障递送等挑战，但本研究无疑为战胜胶质母细胞瘤这一“顽固堡垒”开辟了新的方向。