DNA-PKcs/NF-κB通路通过DNA损伤修复促进肺癌干细胞形成及顺铂耐药的新机制

《Journal of Translational Medicine》：Cisplatin-mediated activation of NF-κB promotes lung cancer stem cell formation via DNA repair pathways

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)顺铂(DDP)耐药难题，深入探讨了DNA修复通路与癌症干细胞(CSCs)在其中的作用机制。研究发现DDP通过激活非同源末端连接(NHEJ)通路中的DNA-PKcs，进而促进p65磷酸化(S536)和p300介导的乙酰化(K310)，持续激活NF-κB信号，最终增强肺癌干细胞特性并导致化疗耐药。联合使用DNA-PKcs抑制剂NU7441可显著增强DDP的抗肿瘤效果，为克服NSCLC化疗耐药提供了新的治疗策略。

　　

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占绝大多数。铂类化疗药物，特别是顺铂(DDP)，是NSCLC治疗的基石。然而，DDP耐药性显著影响其治疗效果，导致患者预后不良。DDP通过引起DNA损伤（主要是链内交联）来诱导细胞毒性，从而激活DNA修复机制。肿瘤细胞中强大的DNA修复机制，如非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)，在DDP耐药中起关键作用。因此，揭示获得性耐药的潜在机制对于阻止肺癌进展和治疗失败至关重要。

近年来研究发现，DNA修复通路不仅参与DDP耐药，还调控着癌症干细胞(CSCs)。CSCs是具有自我更新和分化能力的肿瘤细胞亚群，能够在治疗后再生，对化疗、靶向治疗和免疫治疗的耐药性发展至关重要。此外，NF-κB信号通路在调节癌症干性和化疗耐药中扮演重要角色。然而，NF-κB如何与DNA修复通路相互作用，从而在DDP耐药的NSCLC中增强癌症干性的具体机制尚不清楚。发表在《Journal of Translational Medicine》上的这项研究，旨在阐明DDP耐药机制，重点关注DNA修复通路和CSCs在NSCLC中的作用。

研究人员综合利用了临床组织样本（60例肺癌组织）、体外细胞模型（A549及其DDP耐药株A549/DR）、患者来源的肺癌类器官(PDOs)以及细胞系来源的异种移植(CDX)模型等关键技术方法。通过免疫组化、Western blotting、免疫荧光、球体形成实验、报告基因检测（HR/NHEJ）、免疫共沉淀、体外激酶实验、RNA测序和体内动物实验等多种技术手段，深入探究了DNA修复机制、CSC形成和NF-κB激活在DDP耐药NSCLC中的相互作用。

DDP通过NHEJ通路激活肺癌细胞的DNA修复

研究首先发现，DDP处理可瞬时上调DNA双链断裂(DSBs)标志物γ-H2AX，但在药物移除后其水平下降，表明细胞存在有效的DNA修复反应。报告基因检测显示，短期DDP处理（2小时）后撤药显著增强了A549细胞中的NHEJ修复活性。mRNA和蛋白水平分析进一步证实，DDP主要上调了NHEJ通路核心组分（KU70、KU80、DNA-PKcs）的表达和磷酸化，而同源重组(HR)相关因子（BRCA1、RAD51）则无明显变化。在DDP耐药的A549/DR细胞中，γ-H2AX水平持续较高但能在24小时后下降，且NHEJ组分（尤其是DNA-PKcs和KU80）显著上调，NHEJ活性异常升高。为了在更具临床相关性的模型中验证这些发现，研究人员建立了6个具有不同DDP敏感性的肺癌患者来源类器官(PDOs)。结果显示，耐药患者的类器官(LCO1-3)相较于敏感患者的类器官(LCO4-6)，表现出更高效的DNA修复（γ-H2AX染色降低）和更高的NHEJ修复相关基因表达。对60例患者肿瘤组织的免疫组化分析显示，磷酸化DNA-PKcs(p-DNA-PKcs)和KU80在DDP耐药肿瘤中表达更高，且p-DNA-PKcs高表达与淋巴结转移、远处转移、肿瘤分级差及患者预后不良相关。

DDP诱导的DNA修复促进NSCLC中CSC的形成

研究表明，DDP处理24小时后，A549细胞中干细胞相关基因（ALDH1A1、SOX9、KLF4、CD133、Nanog）的表达显著增加，肿瘤球形成能力也增强。DDP耐药的A549/DR细胞比敏感A549细胞产生更多的肿瘤球。mRNA和蛋白水平分析均证实，A549/DR细胞中干性标志物表达上调。在PDOs模型中，耐药类器官也表现出比敏感类器官更高的干性标志物表达水平。来自耐药患者的LCO1细胞在体内表现出比来自敏感患者的LCO4细胞更强的致瘤能力。为了确定是DNA修复过程而非DNA损伤本身诱导的突变导致了CSC形成，研究人员用DNA修复抑制剂放线菌素D处理A549细胞，结果发现干性标志物的蛋白水平显著降低，表明DNA修复过程对于化疗后NSCLC细胞干性的维持至关重要。

通过p300介导的p65乙酰化激活NF-κB以维持NSCLC的癌症干性

RNA测序数据显示，NF-κB信号通路在A549/DR细胞中显著富集。研究发现，DDP耐药组织和细胞（A549/DR、耐药类器官）中NF-κB的转录活性和p65的核转位增强。然而，与A549细胞相比，A549/DR细胞中经典NF-κB通路关键组分IKK和IκB的磷酸化水平并未改变，提示NF-κB的激活可能通过替代机制。对p65蛋白翻译后修饰的分析发现，A549/DR细胞中p65在S536位点的磷酸化和K310位点的乙酰化水平显著增加，而甲基化水平无变化。免疫共沉淀实验确定p300是负责A549/DR细胞中p65乙酰化的组蛋白乙酰转移酶。抑制p300可下调p65乙酰化，抑制NF-κB活性和NHEJ激活，并降低A549/DR细胞中干性标志物的表达。

p-DNA-PKcs诱导的p65磷酸化是DDP耐药细胞中其乙酰化和NF-κB激活的先决条件

研究发现，在A549/DR细胞中敲低DNA-PKcs（而非KU80）可显著抑制NHEJ活性、NF-κB转录活性和p65核滞留，并降低p65 S536磷酸化和K310乙酰化水平（S276磷酸化不变）。同时，RSK1的磷酸化上调被DNA-PKcs敲低完全抑制。在类器官模型中也得到一致结果。敲低DNA-PKcs显著损害了A549/DR细胞富集CSCs的能力，表现为干性标志物（KLF4、CD133、SOX9、Nanog、ALDH1A1）表达降低和肿瘤球形成能力下降。此外，敲低DNA-PKcs后，A549/DR细胞和耐药类器官在DDP处理后仍显示强烈的γ-H2AX染色，表明DNA损伤修复受损。重要的是，敲低DNA-PKcs部分逆转了A549/DR细胞和耐药类器官对DDP的耐药性。

DNA-PKcs的药理学抑制在体外增强DDP的抗肿瘤作用

使用高选择性DNA-PKcs抑制剂NU7441进行处理，发现1 μM NU7441可显著抑制NHEJ。NU7441增强了DDP诱导的A549/DR细胞DNA损伤（γ-H2AX清除受损），并与DDP联用增加了类器官中的γ-H2AX水平。研究还特别评估了NHEJ和HR通路在介导耐药中的作用，发现联合抑制PARP1（靶向HR）和NU7441，在增加DNA损伤或抑制生长方面并未显示出比DDP+NU7441双药联合更多的益处，且HR通路抑制并未增强NU7441介导的CSC特性抑制，表明DDP耐药主要依赖于NHEJ激活，而无显著的HR通路补偿。低剂量NU7441显著降低了耐药癌细胞中CSC的富集，表现为干性关键标志物表达下降和球体形成能力减弱。DDP和NU7441联合处理增加了A549/DR细胞中cleaved PARP和cleaved Caspase3的水平，并在类器官中协同增强了Caspase3表达，表明促进了凋亡。RNA-seq分析显示，A549/DR细胞中CSC相关基因（如ALDH1A1、SOX9、KLF4、CD133、Nanog）显著上调，而DNA-PKcs抑制可逆转这一现象。KEGG富集分析证实，DNA-PKcs抑制同时抑制了NF-κB信号、DNA损伤修复和细胞干性相关通路。

靶向DNA-PKcs克服NSCLC中DDP耐药的在体证据

在体内实验中，A549异种移植模型显示DDP单药能显著抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。而在A549/DR耐药模型中，DDP单药效果甚微，但DDP与NU7441联合治疗则表现出显著的抗肿瘤反应。联合治疗显著降低了肿瘤组织中p-p65的水平，同时抑制了p65的K310乙酰化和p300的表达，并显著降低了干性标志物（ALDH1A1、KLF4、Nanog、SOX9、CD133）的表达。这种改善的肿瘤反应与肿瘤细胞凋亡增加相关。

本研究揭示了DNA-PKcs通过诱导p65磷酸化和乙酰化激活NF-κB，从而绕过经典的IKK/IκB通路的新机制。NF-κB的激活不仅促进了DNA修复，还增强了CSC特性，共同导致了NSCLC的DDP耐药。靶向DNA-PKcs（例如使用NU7441抑制剂）不仅能增强DDP诱导的DNA损伤，还能减少CSC的富集，为克服化疗耐药提供了极具前景的策略。这项研究深化了对DDP耐药机制的理解，特别是阐明了DNA修复、NF-κB信号和癌症干细胞三者之间的内在联系，为NSCLC的精准治疗和联合用药策略的开发奠定了重要的理论基础和实验依据。尽管研究存在临床样本量有限、NU7441的临床转化需进一步验证等局限性，但其发现为未来开发针对DNA-PKcs-NF-κB轴的新型疗法指明了方向。