为尼帕病毒研究与诊断测试开发一种稳定表达Ephrin-B2的猪细胞系

《Microbiology and Immunology》：Development of a Porcine Cell Line Stably Expressing Ephrin-B2 for Nipah Virus Research and Diagnostic Testing

本研究开发了一种稳定表达猪源性Ephrin-B2的PK-15细胞系，显著提高了尼帕病毒（NiV）伪病毒感染性（>1000倍），并成功应用于病毒中和试验。该细胞系还能抵抗干扰素影响，为猪源病毒研究提供了高效工具。

　　Nipah病毒（NiV）是一种高度致病性的动物源性病毒，能够通过蝙蝠传播给人类，而猪则是其重要的中间宿主。这种病毒不仅对人类健康构成严重威胁，也对猪养殖业造成巨大的经济损失。NiV感染后，患者常表现出严重的中枢神经系统症状，甚至导致死亡，而在猪体内则主要引发呼吸系统和神经系统病变。由于NiV的宿主范围广泛，且在不同宿主中表现出不同的感染症状，因此，开发一种能够高效支持NiV复制的细胞系对于病毒研究、疫苗开发以及临床诊断具有重要意义。

目前，世界动物卫生组织（WOAH）推荐使用源自非洲绿猴的Vero细胞来分离NiV。然而，由于NiV在不同宿主中表现出不同的感染特征，使用猪源性细胞系可能更有利于研究猪源性NiV的传播和复制特性。因此，本研究旨在构建一种高度易感NiV的猪源性细胞系，以提高病毒分离和研究的效率。

在研究中，科学家们利用猪源性PK-15细胞，通过稳定表达猪源性的ephrin-B2蛋白，构建了新的细胞系PK-15/Ephrin-B2。ephrin-B2被认为是NiV的主要受体之一，其在哺乳动物中的高度保守性解释了NiV广泛的宿主范围。通过基因工程手段，研究人员将猪的ephrin-B2基因克隆到特定的病毒载体中，并成功转染到PK-15细胞中，从而获得具有稳定表达ephrin-B2的细胞株。此外，为了进一步提高细胞对NiV的敏感性，科学家还构建了缺乏Stat2基因的PK-15细胞系，这些细胞在存在I型干扰素（IFN）的情况下仍能维持较高的病毒感染率，从而为临床样本的病毒检测提供了更优的平台。

实验结果表明，PK-15/Ephrin-B2细胞对NiV伪病毒的感染率显著高于野生型PK-15细胞，提升了超过1000倍。相比之下，Vero细胞对NiV伪病毒的感染率则低了约30倍。这说明，PK-15/Ephrin-B2细胞在NiV研究中具有更高的效率。同时，研究人员还测试了这些细胞在存在I型干扰素的情况下对病毒的感染情况，发现PK-15/Stat2 k/o/Ephrin-B2细胞在干扰素环境下仍能维持较高的感染效率，从而为病毒在实际样本中的分离提供了更大的可能性。

此外，PK-15/Ephrin-B2细胞在中和试验中表现出良好的性能。使用针对NiV的超免疫腹水液进行中和测试时，这些细胞能够有效识别并中和伪病毒，这进一步验证了其在疫苗研发和抗病毒抗体筛选中的潜在价值。相比之下，其他类型的病毒载体（如VSV-G伪病毒）在这些细胞中感染率没有显著变化，说明PK-15/Ephrin-B2细胞对NiV的感染依赖于ephrin-B2的表达，而非其他通用的病毒受体。

研究还发现，ephrin-B2在不同哺乳动物中的序列相似性约为94%，而人类与猪的ephrin-B2序列相似性则达到了97%。这一结果表明，NiV在哺乳动物中的传播能力可能与其受体的保守性有关。同时，通过构建NiV伪病毒，研究人员进一步验证了这些细胞在病毒研究中的应用价值。此外，通过构建系统发育树，研究人员分析了不同物种中ephrin-B2的进化关系，这有助于理解NiV的跨物种传播机制。

尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。例如，目前的实验使用的是伪病毒，而非具有复制能力的NiV，因此需要在生物安全四级（BSL-4）实验室中进一步验证这些细胞在真实病毒复制中的表现。此外，虽然ephrin-B2的稳定表达对NiV感染有促进作用，但其对其他非依赖ephrin-B2的病毒是否具有潜在影响，仍需进一步研究。

综上所述，本研究成功构建了一种能够高效支持NiV感染的猪源性细胞系，这为NiV的分离、传播机制研究以及疫苗和抗病毒药物的开发提供了重要的工具。此外，该细胞系还为研究其他依赖ephrin-B2的亨尼帕病毒（Henipavirus）提供了新的方向。未来的研究将重点评估这些细胞在实际病毒分离中的应用效果，并进一步探索其在猪源性病毒研究中的潜力。