低深度全基因组测序检测小片段拷贝数变异的性能评估：窗口大小与测序深度的优化策略

《BMC Medical Genomics》：Performance testing for the sensitivity and resolution of low-pass WGS for small CNV detection

本研究针对低深度全基因组测序(LP GS)检测小片段拷贝数变异(CNVs)时窗口选择参数影响不明的问题，系统评估了不同滑动窗口(50-Kb/5-Kb步进 vs 10-Kb/1-Kb步进)与测序深度(10-100 M reads)对检测灵敏度与分辨率的影响。结果表明10-Kb窗口在检测≤30 Kb CNVs时灵敏度达100%，结合≥50 M reads可平衡检测效能与解读负荷，为临床LP GS参数优化提供了关键依据。

　　

在遗传诊断领域，拷贝数变异（CNV）作为染色体片段异常增加或减少的结构变异，是导致发育障碍、先天畸形等多种疾病的重要遗传学病因。传统的染色体微阵列分析（CMA）虽是CNV检测的金标准，但其成本较高、检测周期较长。近年来，低深度全基因组测序（LP GS，亦称CNV-seq）凭借其高通量、低成本的优势，逐渐成为产前诊断中CNV筛查的重要工具，并被中国相关指南推荐为胎儿结构异常的一线诊断方法。然而，LP GS在临床应用中的一个关键挑战在于其对小片段CNV（尤其是小于100 Kb的变异）的检测能力尚未得到充分评估。其中，生物信息学分析流程中的核心参数——滑动窗口的大小与步进设置，可能显著影响检测的灵敏度与分辨率，但此前缺乏系统性的研究来指导这一参数的选择。这直接关系到检测的精准度，进而影响临床决策。因此，迫切需要一种科学的方法来评估不同分析参数对LP GS性能的影响，以优化其在检测小CNV方面的应用。

为了回答上述问题，由西安交通大学等单位研究人员组成的研究团队在《BMC Medical Genomics》上发表了最新研究。本研究巧妙地结合了模拟样本构建与临床病例回顾分析两种策略。首先，研究人员利用simuG和Wgsim工具，构建了4个包含19个预定义CNV（大小包括10 Kb、30 Kb、50 Kb和100 Kb）的模拟人类基因组，并进一步通过随机下采样生成了40个具有不同测序深度（10 M至100 M reads）的模拟样本。其次，研究纳入了57例具有明确CMA结果的临床病例（27例阳性病例包含41个小CNV，30例阴性病例），这些病例的原始测序数据来源于浙江大学医学院附属妇产科医院并已存入GSA-Human数据库（编号HRA003179）。针对这些数据，研究团队分别采用两种滑动窗口算法（50-Kb窗口/5-Kb步进和10-Kb窗口/1-Kb步进）进行LP GS分析，以评估其对检测灵敏度、特异性及分辨率的影响。分析过程均采用盲法，以确保结果的客观性。

研究结果

真实阳性率与分辨率评估（模拟样本）

对40个模拟样本的分析显示，总体而言，随着测序深度的增加（从10 M到100 M reads），无论是缺失（Deletion）还是重复（Duplication）CNV，其检测的真实阳性率均呈现上升趋势。然而，窗口大小的选择对检测性能，尤其是对小CNV的检测，产生了决定性影响。对于大于等于50 Kb的CNV，两种窗口算法（50-Kb窗口和10-Kb窗口）均表现出良好的检测能力，真实阳性率无显著差异。但当CNV尺寸缩小至30 Kb时，50-Kb窗口算法的检测能力明显不足，即使测序深度达到100 M，其对30 Kb缺失和重复的真实阳性率也仅为80.0%和77.8%。相比之下，10-Kb窗口算法对所有测序深度下的30 Kb CNV均实现了100%的真实阳性率，显示出显著优势。重叠分析进一步证实，10-Kb窗口算法检测到的CNV区域与预定义CNV区域的重叠百分比变异更小，尤其是在≤30 Kb的CNV中，这表明该算法具有更高的检测分辨率，能更精确地界定CNV的边界。

测序深度评估与额外解读工作量分析

尽管10-Kb窗口算法对小CNV检测更敏感，但研究者也关注到其可能带来的额外解读负担。通过分析不同测序深度下平均需要解读的CNV数量（可视为潜在假阳性或需要进一步鉴定的变异数量），研究发现，对于10-Kb窗口，当测序深度达到约50 M reads时，额外解读的CNV数量趋于稳定（平均增加约5.125个）。而对于50-Kb窗口，这一平台期出现在30 M reads附近（平均增加约2.125个）。这表明，虽然10-Kb窗口提高了灵敏度，但也引入了更多的需要人工解读的候选变异，增加了临床解读的工作量。从精确度（Precision）角度看，10-Kb窗口算法在提升真实阳性率的同时，其精确度相对较低，反映了该方法会产生相对较多的假阳性信号。因此，在选择参数时需要在检测灵敏度与解读效率之间取得平衡。综合真实阳性率和解读工作量，研究推荐使用10-Kb窗口/1-Kb步进算法并结合≥50 M reads的测序深度来检测大多数小CNV。

检测灵敏度与特异性评估（临床病例）

在57例临床病例的验证中，LP GS的平均测序深度约为0.6685倍基因覆盖率（约57.30 M高质量唯一比对 reads）。以CMA结果为金标准，50-Kb窗口算法和10-Kb窗口算法的检测灵敏度分别为85.19%（23/27）和96.30%（26/27）。10-Kb窗口算法成功检出了除1个25.8 Kb缺失外所有被50-Kb窗口算法遗漏的CNV，显著提升了对小CNV的检出能力。该25.8 Kb CNV未被检出的原因可能与该区域基因组复杂性（如高同源性）有关，这超出了LP GS当前方法的检测极限。在特异性方面，两种算法均在一例阴性样本（N6）中检测到一个临床意义未明（VUS）的CNV，在其余29例阴性样本中均未报告致病性CNV，因此特异性均为96.67%（29/30）。这一结果证实了优化后的LP GS参数在真实临床场景下具有良好的检测性能。

研究结论与意义

本研究通过系统的模拟样本构建和临床病例验证，首次全面评估了滑动窗口参数对LP GS检测小CNV性能的影响。研究结论明确指出，窗口选择与测序深度共同决定了LP GS对小CNV的检测灵敏度与分辨率。对于需要检测≤30 Kb CNV的临床实验室，推荐采用10-Kb窗口/1-Kb步进的算法，并配合≥50 M reads的测序深度，以实现高灵敏度与可接受解读负荷之间的最佳平衡。若实验室仅关注≥100 Kb的CNV，则50-Kb窗口算法已足够。研究强调，窗口大小并非越小越好，需根据临床检测需求（目标CNV大小）和实验室解读能力进行权衡。本研究不仅为LP GS的临床参数优化提供了直接、实用的指导，还建立了一套基于模拟样本的可行性评估路径，特别适用于临床资源有限但需聚焦于高发、重要CNV检测的实验室。该研究推动了LP GS技术在精准遗传诊断中的应用标准化，对提升产前及遗传病诊断的准确性具有重要意义。