SNAP23缺陷通过触发Trim21线粒体转位抑制TFAM介导的氧化代谢并驱动结直肠癌化疗耐药

《Cell Death & Disease》：SNAP23 deficiency triggers Trim21 mitochondrial translocation to suppress TFAM-mediated oxidative metabolism and drive chemoresistance in colorectal cancer

本研究针对结直肠癌(CRC)化疗耐药难题，揭示了细胞膜蛋白SNAP23通过调控线粒体功能影响奥沙利铂(OXA)化疗敏感性的新机制。研究人员发现SNAP23缺失可释放E3泛素连接酶Trim21，使其转位至线粒体，促进线粒体转录因子A(TFAM)的泛素化降解，从而抑制氧化磷酸化(OXPHOS)和活性氧(ROS)产生，最终导致化疗耐药。该研究为克服CRC化疗耐药提供了新的潜在靶点。

　　

在全球范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)仍然是癌症相关死亡的第二大主要原因。化疗在结直肠癌的非手术治疗中占据核心地位。奥沙利铂(Oxaliplatin, OXA)是晚期结直肠癌常用的化疗药物，但耐药性问题导致患者预后不佳。因此，迫切需要开发有效的方法来增强化疗敏感性，这有望显著提高结直肠癌患者的生存率和预后。

肿瘤细胞中的氧化应激特征表现为活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的产生与细胞抗氧化防御机制之间的失衡。当ROS水平超过临界阈值时，会造成显著的分子损伤，导致细胞死亡，多种抗癌疗法（包括化疗）正是利用了这一现象。然而，化疗耐药仍然是癌症治疗失败的主要原因。癌细胞通过ROS调节机制破坏氧化还原稳态，这促进了肿瘤进展并导致化疗耐药。

突触体相关蛋白23(Synaptosomal-associated protein 23, SNAP23)是SNARE复合体的重要组成部分，该复合体负责协调细胞内囊泡与膜的融合以调节胞吐作用。SNAP23在多种细胞类型中高表达，并在多种癌症的发病机制中扮演关键角色。先前的研究已证实SNAP23能够促进结直肠癌的进展。作为一种潜在的癌细胞代谢调节因子，SNAP23能够调节线粒体内的氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)水平，从而影响结直肠癌的进展。此外，ROS作为细胞呼吸的副产物，是细胞内信号通路的关键调节因子。因此，研究人员推测，SNAP23对OXPHOS的调节可能影响ROS介导的癌细胞损伤。

在这项发表于《Cell Death & Disease》的研究中，研究人员观察到在OXA耐药的结直肠癌组织中，SNAP23的表达显著下调。这种下调伴随着OXPHOS速率和ROS水平的下降，从而削弱了OXA通常诱导的氧化应激。从机制上讲，SNAP23通过竞争性抑制Trim21介导的泛素化，从而抑制了线粒体转录因子A(Mitochondrial Transcription Factor A, TFAM)的后续降解。因此，SNAP23水平降低导致Trim21释放增加，后者捕获TFAM并损害OXPHOS和ROS的产生。这些发现为预测结直肠癌治疗结果和确定提高化疗敏感性的靶点提供了新的见解。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们利用了临床结直肠癌组织样本（包括新辅助化疗敏感与不敏感患者的活检组织）进行免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling, TUNEL)检测和蛋白质印迹(Western Blot, WB)分析。在细胞模型中，通过短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)敲低和过表达技术调控SNAP23、TFAM和Trim21的表达，并利用细胞活力检测（如磺基罗丹明B assay）、流式细胞术(Fluorescence-activated Cell Sorting, FACS)分析细胞凋亡和ROS水平、线粒体膜电位和线粒体ROS。通过Seahorse能量分析仪评估细胞耗氧率(Oxygen Consumption Rate, OCR)和备用呼吸容量(Spare Respiratory Capacity, SRC)。利用蛋白质半衰期测定、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)、泛素化分析、免疫荧光(Immunofluorescence, IF)和线粒体分离纯化等技术探讨了蛋白质相互作用、降解和亚细胞定位。此外，还建立了细胞源性异种移植(Cell-derived Xenograft, CDX)小鼠模型进行体内药效评估。

临床意义及体外验证

研究人员首先探讨了SNAP23在结直肠癌中的临床意义。他们评估了SNAP23是否能作为基于OXA的新辅助化疗(Neoadjuvant Chemotherapy, NACT)疗效的标志物。结果显示，在治疗不敏感患者（疾病进展/稳定，PD/SD）的活检组织中，SNAP23的表达低于治疗敏感患者（完全缓解/部分缓解，CR/PR）。免疫组织化学染色结合TUNEL实验表明，在不敏感结直肠癌患者的标本中，低SNAP23表达显著减少了肿瘤细胞损伤。SNAP23阳性和TUNEL阳性肿瘤细胞的数量在不敏感组织中显著减少。蛋白质印迹分析进一步证实，与敏感组织相比，不敏感组织中SNAP23蛋白水平降低。

在体外实验中，研究人员在SW620和HT29结直肠癌细胞系中敲低了SNAP23。磺基罗丹明B实验表明，SNAP23敲低显著增强了细胞对OXA的耐药性。相反，在SNAP23敲低的细胞中恢复SNAP23表达，可以逆转这种耐药效应。流式细胞术分析显示，SNAP23敲低减少了OXA诱导的细胞凋亡，而恢复SNAP23则增加了凋亡细胞的比例。蛋白质印迹分析也证实，SNAP23敲低降低了OXA处理引起的PARP、caspase-9和caspase-3的切割。

鉴于SNAP23敲低在体外显著增强了耐药性，研究人员随后使用稳定敲低SNAP23的HT29细胞评估了体内的抗肿瘤活性。他们观察到，与对照组相比，SNAP23敲低组的肿瘤重量和体积减小。然而，SNAP23缺陷联合OXA治疗也表现出耐药效应。SNAP23的敲低抑制了结直肠癌细胞的致瘤性，并显著增加了裸鼠对OXA化疗的耐受性。此外，病理分析显示，对照组和SNAP23恢复组的肿瘤细胞凋亡增加。与预期一致，从SNAP23敲低的异种移植组织中分离出的结直肠癌细胞，其ROS水平显著低于对照组和SNAP23恢复组。这些结果表明，肿瘤细胞对OXA的耐药性确实与SNAP23的表达水平相关。

SNAP23通过下调ROS水平介导化疗耐药

研究人员评估了OXA对体外模型中ROS水平的影响，发现用不同浓度和不同时间的OXA处理亲本细胞可诱导ROS生成。最初，用OXA处理的亲本SW620和HT29细胞表现出凋亡细胞显著增加。同时，ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine, NAC)可部分挽救细胞免于凋亡。研究人员进一步研究了OXA处理期间与SNAP23相关的细胞死亡途径。对于凋亡，通过caspase-3活性检测试剂盒测量，caspase-3的激活显著增加。蛋白质印迹分析显示，OXA处理增加了切割的PARP、caspase-9和caspase-3。

鉴于NAC处理观察到的挽救效应，研究人员首先测量了总ROS和线粒体ROS(mitochondrial ROS, mitoROS)水平，发现无论是否经过OXA处理，SNAP23缺陷细胞的总ROS和mitoROS水平均显著低于对照组和恢复组。这与线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential, ΔΨm)的降低一致。为了确定OXA诱导的凋亡是否由ROS产生介导，研究人员利用NAC来中和增加的ROS。结果表明，OXA通过诱导ROS依赖性凋亡和抑制肿瘤细胞增殖来发挥其抗肿瘤作用。有趣的是，在SNAP23恢复的细胞中观察到了相反的效果和ROS水平的增加。重要的是，NAC显著挽救了OXA在结直肠癌细胞中诱导的细胞死亡和抑制。此外，NAC处理抑制了OXA处理诱导的PARP、caspase-9和caspase-3的激活。总之，SNAP23缺陷导致的ROS水平降低，与基于OXA的化疗相结合，抑制了细胞凋亡，这可能是耐药的关键。

SNAP23敲低细胞保持更好的线粒体功能和完整性，但线粒体含量和呼吸能力较低

先前的研究已确定SNAP23是线粒体代谢表型的关键调节因子。此外，发现在SNAP23表达被抑制的结直肠癌细胞中，线粒体TFAM减少。为了阐明SNAP23调节OXPHOS影响OXA作用下ROS介导的癌细胞损伤的机制，研究人员将重点放在了耐药背景下的线粒体功能上，因为线粒体是细胞内ROS的主要来源。

研究人员首先研究了结直肠癌细胞中线粒体的亚细胞定位和表达。共聚焦显微镜显示，在用shSNAP23转染的SW620和HT29细胞中，线粒体质量减弱，表明SNAP23可能有助于线粒体的维持。值得注意的是，单独用OXA处理并未显著改变这些细胞中的线粒体质量，表明观察到的变化与SNAP23敲低特异性相关，而非OXA的直接效应。透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)分析揭示了OXA处理72小时后线粒体形态的明显变化。在亲本细胞和SNAP23恢复的细胞中，OXA暴露诱导了线粒体嵴的部分解体，这种表型在未处理的对照组中未观察到。相比之下，无论是否经OXA处理，SNAP23缺陷细胞都保持了相对完整的线粒体超微结构。这些发现表明，SNAP23在介导OXA诱导的线粒体损伤中起关键作用。通过TMRM荧光强度降低测量，SNAP23敲低细胞中的线粒体膜电位显著低于对照组。OXA处理在亲本和SNAP23恢复的细胞中引起了中度但显著的去极化，而SNAP23缺陷细胞除了基线去极化状态外，对OXA没有表现出额外的反应。这些发现表明SNAP23对于维持线粒体膜电位至关重要，并调节OXA诱导的去极化。

研究人员使用Seahorse分析仪评估了SNAP23敲低和恢复后SW620和HT29细胞的代谢表型。与对照组和SNAP23恢复组相比，SNAP23缺陷细胞的基础耗氧率(Basal OCR)和备用呼吸容量(Spare Respiratory Capacity, SRC)显著降低。与预期一致，SNAP23缺陷细胞中的线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)拷贝数显著低于对照组和SNAP23恢复的细胞。此外，OXPHOS蛋白（包括COX1、SDHA、ATP5A1和ATP6V1E1）的表达水平在SNAP23敲低细胞中显著下调，但在SNAP23恢复组中保持与对照细胞相似的水平。研究人员还证实，TFAM表达在SNAP23敲低的HT29和SW620细胞中均下调。对39例结直肠癌组织样本的IHC染色显示，敏感组织中的TFAM表达显著高于不敏感组织，这与SNAP23的表达相关。

总之，这些发现表明，耐药细胞（shSNAP23）尽管线粒体质量、呼吸能力和线粒体膜电位降低，但仍保持了增强的线粒体效率和结构稳定性。因此，这些细胞在OXA处理时表现出减弱的ROS生成，这有助于其持续的化疗耐药。

TFAM通过调节肿瘤中的ROS水平克服化疗耐药

研究人员进一步探讨了TFAM在SNAP23减弱糖酵解和结直肠癌细胞耐药背景下的作用。为此，他们在SNAP23沉默的细胞和SNAP23稳定表达的细胞中诱导了TFAM过表达。

最初，研究人员利用EDU实验检测了TFAM过表达对细胞增殖的影响。结果表明，敲低SNAP23抑制了细胞增殖，这与先前的实验结果一致。然而，TFAM过表达在SNAP23稳定表达细胞或SNAP23敲低细胞中均不影响细胞增殖。在SNAP23稳定表达细胞中过表达TFAM导致OXA处理时细胞死亡和抑制增加。值得注意的是，在SNAP23沉默细胞中过表达TFAM显著克服了耐药性。此外，与对照细胞相比，TFAM过表达细胞中切割的PARP、caspase-9和caspase-3水平更高。

为确定TFAM过表达是否通过调节ROS产生诱导凋亡，研究人员测量了SNAP23沉默和SNAP23稳定表达细胞中的ROS水平。结果表明，TFAM过表达细胞中ROS生成增加。此外，在SNAP23沉默细胞中过表达TFAM部分恢复了总ROS和mitoROS水平。这与线粒体膜电位(ΔΨm)的增加一致。

随后，研究人员利用NAC来中和TFAM过表达细胞中增加的ROS。肿瘤细胞表现出耐药趋势，因为NAC处理显著挽救了细胞死亡和抑制。此外，NAC处理抑制了OXA处理诱导的PARP、caspase-9和caspase-3的激活。

在最后阶段，利用动物模型临床前评估了TFAM过表达对OXA耐药的影响。对于CDX模型，NOD小鼠皮下注射HT29细胞，然后给予OXA。所有小鼠在治疗期间均存活，且未表现出显著的体重减轻（>15%）或感染或伤口迹象。来源于SNAP23沉默细胞的肿瘤对OXA耐药。然而，当过表达TFAM时，肿瘤质量显著减少。相应地，用OXA处理的shSNAP23+oeTFAM组与其他三组相比，细胞死亡显著更高。有趣的是，与配对的TFAM稳定组相比，TFAM过表达组的肿瘤中ROS水平也增加，这强烈表明肿瘤组织的ROS水平可能通过受TFAM调节而影响其化疗效率。

这些结果表明，TFAM过表达增强了结直肠癌细胞在体内对OXA治疗的敏感性。这种效应似乎是通过提高肿瘤组织中的ROS水平介导的，表明TFAM对ROS的调节在调节化疗疗效中起关键作用。

SNAP23对Trim21介导的TFAM泛素化降解发挥竞争性抑制作用

为了研究TFAM表达是否通过SNAP23经由泛素介导的降解进行调节，研究人员测量了多种结直肠癌细胞系中TFAM的半衰期。他们观察到，敲低内源性SNAP23后，TFAM的半衰期缩短。同时，他们观察到用蛋白酶体抑制剂MG132预处理减少了SW620和HT29细胞中TFAM的降解。此外，免疫共沉淀实验表明，敲低SNAP23促进了TFAM的泛素化，这种泛素化可被MG132预处理捕获，但在SNAP23恢复后被阻断。

研究人员假设SNAP23通过直接物理相互作用调节TFAM活性。然而，初步评估显示SNAP23和TFAM之间没有相互作用。为了系统性地识别TFAM的潜在结合伴侣，研究人员对SW620细胞中TFAM和SNAP23的免疫沉淀组分进行了基于质谱的蛋白质组学分析。出乎意料的是，E3泛素连接酶Trim21与SNAP23和TFAM均发生免疫共沉淀。随后的Co-IP实验证实了Trim21与SNAP23和TFAM在SW620和HT29细胞中的内源性相互作用。

为了进一步探索SNAP23和Trim21之间内源性相互作用的定位和表达水平，研究人员敲低了SNAP23，然后恢复其表达。Co-IP结果表明，SNAP23和TFAM竞争性地与Trim21结合。对SNAP23和Trim21进行染色后，共聚焦显微镜显示SNAP23和Trim21在细胞膜处相互作用，并且在敲低SNAP23后，更多的Trim21被释放到细胞质中。此外，Trim21先前已被鉴定为参与调节蛋白质降解的E3泛素连接酶。为了研究Trim21与TFAM相互作用的结构决定因素，研究人员生成了一系列缺失特定结构域的Trim21缺失突变体。Co-IP分析显示，缺失1-81位氨基酸、1-128位氨基酸和1-268位氨基酸的Trim21突变体保留了与TFAM结合的能力，而缺失268-465位氨基酸的Trim21突变体则失去了这种能力。这些结果表明，包含Trim21的PRY/SPRY结构域的268-465位氨基酸区域对其与TFAM的相互作用至关重要。此外，除了缺失268-465位氨基酸的Trim21突变体外，这些Trim21缺失突变体也保留了与SNAP23结合的能力。这些结果表明，Trim21的268-465位氨基酸（PRY/SPRY结构域）负责其与SNAP23的相互作用。这进一步验证了SNAP23和TFAM竞争性地与Trim21结合。

与这些发现一致，敲低内源性Trim21后，TFAM的半衰期延长，表明Trim21主要通过受SNAP23调节的翻译后修饰来控制TFAM的表达。

研究人员观察到，异位过表达Trim21显著下调了SW620和HT29细胞中TFAM的丰度。然而，这种Trim21介导的TFAM下调被MG132预处理所阻断。一致地，通过shRNA处理敲低Trim21后，TFAM表达上调。此外，结果表明Trim21促进TFAM泛素化。总之，这些发现表明SNAP23竞争性地结合Trim21，从而通过泛素介导的降解调节TFAM的丰度。

为了研究Trim21的亚细胞分布及其与线粒体的潜在关联，研究人员在SW620和HT29结直肠癌细胞系中，使用抗Trim21抗体结合MitoTracker染色进行了免疫荧光染色。在基础条件下，Trim21呈现弥漫性胞质定位。然而，在SNAP23敲低后，观察到Trim21向线粒体募集，这通过其与线粒体的共定位得到证实。

为了进一步验证Trim21与SNAP23和TFAM的内源性结合位点，研究人员从细胞中纯化和提取了线粒体。结果表明，Trim21在线粒体和细胞质中均存在。从用MG132预处理的细胞中纯化了线粒体和细胞质。Co-IP显示，Trim21在细胞质中与SNAP23相互作用，在线粒体中与TFAM相互作用。此外，Co-IP实验表明，Trim21直接在线粒体内促进TFAM泛素化。这一发现支持了研究人员的假设，即SNAP23促进了Trim21向线粒体的转位，使其在线粒体内与TFAM结合。

研究结论与意义

本研究首次确定在治疗不敏感患者（PD/SD）的活检组织中，与治疗敏感患者（CR/PR）相比，SNAP23表达显著降低。IHC染色结合TUNEL实验和WB检测分析证实了治疗不敏感患者中SNAP23表达降低，提示了研究发现的临床重要性。

SNAP23作为一个关键蛋白，协调囊泡锚定和融合的特异性。该蛋白与突触囊泡相关膜蛋白和syntaxin协作，形成一个复合体，作为通用膜融合机制中的关键锚定位点。最近的研究越来越关注SNAP23在肿瘤发生和进展中的作用。本研究证实了SNAP23在结直肠癌化疗反应中的独特调节功能，可能为化疗增敏提供一个潜在靶点。

ROS在癌症进展和化疗耐药中扮演双重角色。化疗药物通常提高细胞内ROS水平，导致氧化应激和随后的癌细胞死亡。然而，癌细胞可以通过上调抗氧化防御机制来调节或适应这些升高的ROS水平，这可以减轻ROS的细胞毒性作用并导致化疗耐药。为了维持对OXA的耐药性并进一步促进肿瘤进展，癌细胞采用策略来减轻过量的ROS产生，从而获得对氧化应激诱导的细胞死亡的耐药性。本研究证实OXA处理在结直肠癌细胞系中诱导ROS生成。出乎意料的是，研究人员在OXA处理后的SNAP23敲低细胞中观察到ROS水平降低，这有助于化疗耐药的持续存在。

为了更充分地理解SNAP23在调节线粒体代谢过程中的作用，研究人员通过Seahorse分析仪确定了代谢表型。SNAP23敲低细胞的基础OCR和SRC降低。在先前的研究中，也证实了下调SNAP23可以抑制结直肠癌细胞的糖酵解。为了进一步验证这一点，研究人员确定了OXPHOS蛋白表达水平，发现转染shSNAP23的结直肠癌细胞中，ATP合成体ATP5A1、复合体II SDHA和复合体IV COX1减少。此外，SNAP23敲低细胞中显示出减弱的线粒体生物合成。这些发现凸显了SNAP23 beyond囊泡运输作用的多方面生物学功能，暗示其参与代谢过程和肿瘤进展，值得进一步研究。

线粒体是ROS产生和氧化还原稳态的主要场所。因此，线粒体生物合成的减少可能导致ROS产生减少，从而降低细胞应激并增强对OXA治疗的适应。值得注意的是，研究表明，从快速生长期过渡到缓慢生长期的结直肠癌细胞可以逃避化疗，因为化疗药物主要靶向快速分裂的细胞。本研究结果表明，敲低SNAP23显著抑制肿瘤细胞增殖。有趣的是，还观察到TFAM的表达随着SNAP23水平的变化而波动。然而，TFAM的表达水平不影响肿瘤细胞的增殖速率。这一发现提示SNAP23表达与化疗耐药之间存在潜在联系。先前的研究表明，SNAP23水平降低会削弱结直肠癌细胞的OXPHOS。

TFAM是一种重要的核编码蛋白，被转运至线粒体，在线粒体DNA的维持、表达和传递中起关键作用。TFAM参与调节mtDNA复制和转录过程。它还与mtDNA核小体样结构的形成、mtDNA修复机制以及mtDNA的整体稳定性有关。乙酰化和磷酸化等翻译后修饰调节TFAM与mtDNA的结合亲和力，从而影响mtDNA动力学。此外，TFAM在调节线粒体内钙水平方面也起重要作用，这对激活线粒体转录至关重要。作为线粒体呼吸链生物合成的主要调节因子，TFAM增强线粒体OXPHOS，强调了其在维持线粒体功能及其对细胞能量产生的潜在影响方面的重要性。TFAM的失调与线粒体功能障碍有关，并与一系列疾病相关。

本研究证明，过表达TFAM会提高线粒体ROS产生并触发肿瘤细胞凋亡，这一过程与线粒体超极化有关，这一发现在实验中得到验证。TFAM作为mtDNA稳定性和拷贝数的关键调节因子，结合mtDNA以维持其结构完整性并促进线粒体基因转录。然而，当过表达时，TFAM导致mtDNA含量不受控制地增加，破坏了电子传递链复合物的化学计量平衡。这种不平衡导致电子泄漏和过量的超氧化物生成，这是线粒体ROS的主要来源。值得注意的是，数据证实TFAM过表达诱导线粒体超极化（升高的ΔΨm），这一现象进一步加剧了ROS的积累。超极化减少了质子跨线粒体内膜的泄漏，延长了电子在ETC中的滞留时间，增加了电子逃逸到氧的可能性，从而放大了线粒体ROS的产生。结直肠癌细胞增加Ca²⁺摄取，从而激活磷酸二酯酶2并抑制线粒体蛋白激酶A的活性，导致TFAM在线粒体中积累的稳定。类似地，其他研究发现，增加的线粒体Ca²⁺摄取上调TFAM表达，促进线粒体生物合成并增加线粒体ROS产生。体外和体内模型显示，基因阻断SNAP23会减弱OXA的抗肿瘤效果。但过表达TFAM可以通过提高ROS水平显著挽救耐药效应。TFAM的下调进一步阐明了抑制其表达可以消除增强OXPHOS效果的原因。

为了进一步阐明SNAP23调节TFAM的机制，研究人员利用了质谱、Co-IP、免疫荧光和线粒体纯化实验。这些综合分析证实，SNAP23和Trim21在细胞膜相互作用，敲低SNAP23后，更多的Trim21被释放到细胞质中。此外，SNAP23竞争性抑制Trim21介导的TFAM泛素化及后续降解。因此，研究人员提出，肿瘤内的OXPHOS水平通过SNAP23-Trim21-TFAM轴进行正向调节。

SNAP23（一种膜相关蛋白）与TFAM（一种线粒体蛋白）之间的相互作用提出了一种有趣的机制，可能涉及蛋白质跨膜转运及其随后的细胞定位改变。驱动这种易位的因素以及细胞定位变化的功能后果是未来研究的重要方向。此外，SNAP23在其他类型肿瘤的代谢过程和化疗耐药中的潜在作用也是未来研究的一个引人入胜的课题。

总之，这项研究深入揭示了SNAP23通过竞争性结合Trim21，调控其线粒体转位，进而影响TFAM稳定性及线粒体氧化代谢，最终决定结直肠癌对奥沙利铂化疗敏感性的新机制。这不仅深化了对化疗耐药机制的理解，也为开发针对SNAP23-Trim21-TFAM轴的新型增敏策略提供了重要的理论依据和潜在的干预靶点。