活化蛋白C通过细胞外囊泡递送microRNA-200a促进肺癌进展的新机制

《Cell Death & Disease》：Activated protein C promotes human lung cancer progression through the release of tumor extracellular vesicles and transfer of microRNA-200a

本研究揭示了凝血蛋白酶活化蛋白C(aPC)通过EPCR-PAR1信号轴激活RhoA-ROCKII-JNK1/2-MLC2通路，诱导肺癌细胞释放富含miR-200a的细胞外囊泡(EVs)，进而促进正常肺上皮细胞恶性转化及化疗耐药。该发现为肺癌治疗提供了新的靶点策略。

　　

在肺癌治疗领域，化疗耐药和肿瘤转移仍是导致患者死亡的主要原因。近年来研究发现，凝血系统与肿瘤进展存在密切关联——肺癌患者常出现高凝状态，其血栓并发症发生率高达5-13%。尤其值得注意的是，凝血酶激活的蛋白C(aPC)不仅能调节凝血平衡，更通过内皮细胞蛋白C受体(EPCR)和蛋白酶激活受体1(PAR1)介导细胞信号传导。尽管前期研究提示aPC可能促进肺腺癌(LUAD)生存转移，但其具体分子机制始终是未解之谜。

这项发表于《Cell Death and Disease》的研究首次揭示：aPC通过EPCR-PAR1驱动的RhoA-ROCKII-JNK1/2-MLC2信号级联反应，触发肺癌细胞释放大量细胞外囊泡。这些囊泡如同微型"特洛伊木马"，将致癌性microRNA-200a递送至正常肺上皮细胞，诱导其恶性转化。更令人惊讶的是，搭载miR-200a的囊泡还能赋予肺癌细胞对紫杉醇(PTX)的耐药性。通过抑制miR-200a或靶向EV生物发生过程，研究人员成功阻断了这一促癌链条，为克服肺癌治疗困境提供了全新视角。

关键技术方法包括：利用纳米颗粒追踪分析(NTA)量化EVs释放，通过siRNA基因沉默技术敲低EPCR/PAR1验证信号通路，采用深度测序筛选EVs中差异表达的miRNAs，结合体外功能实验（CFSE/BrdU增殖实验、Transwell迁移侵袭实验）评估表型变化，并建立BALB/c裸鼠移植瘤模型验证体内肿瘤生长、转移和化疗耐药性。临床数据来源于TCGA、CPTAC等公共数据库的肺癌患者样本分析。

aPC诱导肺癌细胞通过EPCR-PAR1信号释放EVs

研究人员发现aPC以浓度和时间依赖性方式显著增加A549细胞（人肺腺癌细胞系）的EVs释放。通过透射电镜观察到典型囊泡结构，Western blot检测到CD81/CD9/CD63等EV标志蛋白表达上调。利用siRNA沉默EPCR或PAR1后，aPC诱导的EVs生成明显受抑，证实该过程依赖EPCR-PAR1信号轴。

aPC通过RhoA-ROCKII-JNK1/2-MLC2通路触发EV生物发生

机制研究表明，aPC激活后依次引发RhoA-GTP水平升高、ROCKII活化、JNK1/2磷酸化，最终导致MLC2磷酸化。采用Rhosin（RhoA抑制剂）、Y27632（ROCKII抑制剂）和JNK I（JNK1/2抑制剂）预处理，均可显著抑制aPC诱导的EVs释放。时序实验证实该信号通路呈RhoA→ROCKII→JNK1/2→MLC2的线性激活模式。

aPC-EVs促进肺上皮细胞恶性表型及化疗耐药

将等量aPC-EVs与正常肺上皮细胞BEAS-2B共培养后，发现细胞增殖率（CFSE/BrdU实验）提高2.3倍，迁移和侵袭能力（Transwell实验）分别增强3.1倍和2.8倍。更关键的是，aPC-EVs使A549细胞对紫杉醇的耐药性显著提升， caspase-3/7活性下降67%，Bax/Bcl-2比值逆转。

miR-200a是aPC-EVs中的关键效应分子

深度测序显示aPC-EVs中miR-200a表达量较对照组升高7.2倍。通过actinomycin D转录抑制实验证实，受体细胞中miR-200a升高源于EVs直接递送而非新合成。使用anti-miR-200a抑制该miRNA后，aPC-EVs的促癌效应被完全逆转；而将miR-200a mimic加载至对照EVs，可重现aPC-EVs的表型。

miR-200a通过靶向SOX17驱动肿瘤发生

生物信息学分析显示SOX17是miR-200a的直接靶标。aPC-EVs处理使BEAS-2B细胞SOX17蛋白表达下降71%，而anti-miR-200a可恢复其表达。单独敲低SOX17即可模拟aPC-EVs的促癌效应，证实该通路的关键作用。

临床数据验证miR-200a/SOX17的临床相关性

TCGA数据库分析显示：LUAD患者组织中miR-200a表达较正常组织上调4.8倍，而SOX17 mRNA和蛋白水平分别下降62%和57%。Kaplan-Meier分析表明低SOX17表达患者总生存期缩短11.3个月（P<0.001）。

动物实验证实aPC-EVs的体内促癌功能

在BALB/c裸鼠模型中，aPC-EVs处理的BEAS-2B细胞形成肿瘤体积达对照组5.2倍，肺转移灶数量增加3.7倍。移植aPC-EVs预处理的A549细胞后，紫杉醇治疗组肿瘤抑制率仅为27%（对照组为68%）。所有体内效应均可通过anti-miR-200a干预逆转。

本研究系统阐明了凝血蛋白酶aPC通过调控EVs生物学行为促进肺癌进展的新机制。aPC-EPCR-PAR1信号轴激活RhoA-ROCKII-JNK1/2-MLC2通路，改变肌球蛋白动力学，促使肺癌细胞释放富含miR-200a的EVs。这些囊泡通过递送miR-200a至受体细胞，靶向抑制SOX17表达，最终驱动肿瘤恶性进展和化疗耐药。该发现不仅深化了对肿瘤-凝血系统互作的理解，更提示靶向EVs生物发生、miR-200a递送或囊泡摄取机制可能成为肺癌治疗的新策略。值得注意的是，由于aPC本身具有抗凝血功能，直接靶向aPC可能增加血栓风险，因此针对其下游效应通路开发治疗方案具有更重要的临床转化价值。