UCHL3通过ENO1去泛素化调控AKT/CCND1信号轴促进胃癌进展并增强帕博西利敏感性

《Cell Death & Disease》：UCHL3 depletion inhibits gastric cancer progression and enhances palbociclib sensitivity by regulating the AKT/CCND1 signaling axis via ENO1 ubiquitination

本研究聚焦胃癌治疗难题，发现去泛素化酶UCHL3在胃癌组织中高表达且与不良预后相关。研究人员通过多组学分析结合功能实验，揭示UCHL3通过去除ENO1蛋白K48位点的泛素化修饰，稳定ENO1蛋白并激活AKT/CCND1信号通路，从而促进胃癌恶性进展。更重要的是，UCHL3小分子抑制剂TCID可增强胃癌细胞对CDK4/6抑制剂帕博西利的敏感性，为胃癌靶向治疗提供了新的联合治疗策略。

　　

在全球范围内，胃癌仍然是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其高发病率和死亡率持续对公共卫生构成重大挑战。肿瘤细胞的无限增殖和转移是恶性肿瘤的重要特征，也是导致胃癌患者治疗效果不佳的关键因素。因此，探索驱动胃癌增殖和侵袭的分子机制，在复杂的调控网络中发现有价值的生物标志物或治疗靶点，具有极其重要的意义。

泛素羧基末端水解酶L3(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L3, UCHL3)作为去泛iquitinating酶，在泛素-蛋白酶体系统中发挥着重要作用。近年来，UCHL3在多种实体肿瘤中的表达和调控机制受到广泛关注，包括肝细胞癌、乳腺癌和结直肠癌等，但其在胃癌中的具体作用和潜在机制仍需深入探索。

与此同时，CDK4/6抑制剂如帕博西利(palbociclib)等在多种癌症类型中显示出治疗潜力，但在胃癌治疗中的应用仍处于探索阶段。值得注意的是，一项评估吡咯替尼联合达尔西利在HER2阳性晚期胃癌中疗效和安全性的I期临床研究显示出令人鼓舞的结果，为胃癌治疗提供了新选择。

在这项发表于《Cell Death and Disease》的研究中，研究人员通过临床样本和生物信息学分析发现，与癌旁正常组织相比，UCHL3在胃癌组织中过度表达，且表达水平越高，患者预后越差。功能实验表明，UCHL3促进胃癌细胞增殖、侵袭和迁移，加速细胞周期进程，诱导上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)。机制上，UCHL3通过与ENO1相互作用，特异性去除ENO1上K48连接的多聚泛素链，稳定ENO1蛋白，从而激活AKT/CCND1信号通路。更重要的是，UCHL3的小分子抑制剂TCID能够增强胃癌细胞对CDK4/6抑制剂帕博西利的敏感性。

研究采用了多种关键技术方法：通过免疫组织化学分析127例胃癌患者组织芯片中UCHL3表达；利用细胞计数试剂盒-8、集落形成、Transwell和小室侵袭实验评估细胞功能；通过免疫共沉淀、GST-pull down和分子对接技术验证蛋白质相互作用；采用环己酰亚胺蛋白质半衰期实验和体内泛素化分析研究蛋白质稳定性；建立细胞系来源异种移植和患者来源异种移植模型进行体内验证；应用转录组测序和生物信息学分析筛选下游信号通路。

UCHL3在胃癌中过表达且与不良预后相关

研究人员首先通过cBioPortal网站分析了110种去泛素化酶在胃癌中的基因突变模式，发现扩增突变占主导地位。通过TCGA数据和多个GEO数据集的一致性分析，发现UCHL3在胃癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织。对127例胃癌患者的石蜡包埋样本进行免疫组织化学染色验证，证实UCHL3在肿瘤组织中表达更高，且与TNM分期显著相关。UCHL3高表达患者的总生存期显著差于低表达患者。免疫印迹分析和RT-qPCR证实，与正常对照相比，大多数胃癌组织和细胞中UCHL3表达增加。

UCHL3促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移，加速细胞周期进程并诱导EMT

通过使用UCHL3特异性siRNA或过表达质粒调控胃癌细胞中UCHL3的表达，研究人员进行了一系列细胞功能实验。伤口愈合和Transwell侵袭实验表明，UCHL3敲低显著降低了胃癌细胞的迁移和侵袭能力，而过表达UCHL3则增强了这些特性。EMT相关标志物表达变化显示，UCHL3敲低组E-钙黏蛋白表达升高，N-钙黏蛋白和波形蛋白表达降低，而过表达组呈现相反趋势。CCK-8实验、集落形成实验和EdU实验一致表明，UCHL3敲低抑制了胃癌细胞的增殖能力，而过表达则产生相反效果。流式细胞术分析进一步显示，UCHL3缺失诱导G1/S期阻滞，而过表达UCHL3促进了G1/S期转换。

UCHL3调控AKT/CCND1信号通路

为了深入研究UCHL3驱动胃癌进展的机制，研究人员在沉默UCHL3的胃癌细胞中进行了转录组测序，鉴定出991个差异表达基因。KEGG通路分析显示，差异表达基因显著富集于PI3K/AKT通路，其中AKT的关键下游靶点CCND1表现出明显的差异表达。Western blotting分析表明，UCHL3敲低降低了磷酸化AKT(S473)和CCND1蛋白表达，而过表达产生相反效果，且对总AKT水平无影响。抑制剂实验使用MK-2206证实，UCHL3通过AKT激活CCND1。

UCHL3与ENO1相互作用

通过免疫沉淀和质谱分析，研究人员鉴定出UCHL3的潜在相互作用蛋白，包括ENO1。分子对接显示UCHL3与ENO1之间存在强相互作用。外源性和内源性Co-IP实验证实了二者的相互作用，GST-pull down实验使用纯化的His-UCHL3和GST-ENO1融合蛋白确认了两种蛋白质之间的直接相互作用。免疫荧光染色显示UCHL3和ENO1在胃癌细胞质中共定位。通过构建一系列截短质粒，发现UCHL3(179-230 AA)片段与ENO1(140-434 AA)片段相互作用。

UCHL3去泛素化并稳定ENO1

研究发现，调控UCHL3表达可相应改变ENO1蛋白水平。环己酰亚胺蛋白质半衰期实验表明，UCHL3过表达延长了ENO1的半衰期，而UCHL3沉默则缩短了其半衰期。体内泛素化实验验证了UCHL3通过去泛素化稳定ENO1。C95A点突变显著损害了UCHL3对ENO1的去泛素化功能。进一步研究发现，UCHL3特异性去除ENO1上K48连接的多聚泛素链，且主要作用于ENO1的赖氨酸92位点。

ENO1是UCHL3调控AKT/CCND1信号通路的关键介质

研究人员将UCHL3过表达质粒和ENO1 siRNA共转染至胃癌细胞，观察AKT/CCND1信号轴和细胞功能的变化。结果显示，UCHL3过表达激活了AKT/CCND1信号轴，而ENO1 siRNA部分逆转了UCHL3对AKT/CCND1信号轴的激活。功能实验结果表明，ENO1 siRNA显著抑制了UCHL3对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的促进作用。临床验证显示，UCHL3与ENO1表达呈显著正相关，同时高表达这两种标志物的患者预后显著差于低表达患者。

UCHL3在体内促进肿瘤进展

通过建立细胞系来源异种移植和患者来源异种移植模型，研究人员在体内验证了UCHL3的促癌作用。在HGC-27细胞构建的异种移植瘤中，沉默UCHL3导致肿瘤增殖减少，肿瘤体积和重量减小。而在MKN-28细胞中过表达UCHL3则促进了胃癌细胞的体内增殖。免疫组织化学和Western blotting分析显示，UCHL3沉默肿瘤中ENO1、p-AKT和CCND1水平降低，而过表达UCHL3则提高了这些蛋白水平。患者来源异种移植模型实验进一步证实了UCHL3靶向治疗的潜在临床相关性。

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TCID抑制UCHL3功能并增加胃癌细胞对CDK4/6抑制剂的敏感性

4,5,6,7-四氯茚-1,3-二酮(TCID)是UCHL3的有效选择性抑制剂。研究发现，TCID以剂量依赖性方式显著降低ENO1蛋白水平，并抑制UCHL3介导的ENO1去泛素化。同时，TCID抑制了胃癌细胞的增殖和侵袭。更重要的是，TCID与帕博西利联合使用时，在体外和体内均显示出比单药治疗更高的抗肿瘤效果。免疫组织化学分析显示，TCID组中UCHL3的下游靶点ENO1、p-AKT和CCND1显著降低，而帕博西利单药组CCND1表达略高于对照组，进一步支持了CCND1表达增加可能导致帕博西利耐药的观点。

本研究通过临床样本和体内外模型阐明了UCHL3在胃癌中的致癌作用。机制上，UCHL3通过去除ENO1上的K48连接多聚泛素链，增加ENO1蛋白表达，激活AKT/CCND1通路，从而促进胃癌进展。更重要的是，TCID抑制UCHL3可增强胃癌细胞对CDK4/6抑制剂的敏感性。这些发现不仅揭示了UCHL3-ENO1-AKT/CCND1轴在胃癌进展中的关键作用，还为胃癌治疗提供了新的潜在靶点和联合治疗策略。UCHL3作为治疗靶点的发现，特别是其抑制剂TCID与CDK4/6抑制剂的协同作用，为克服当前靶向治疗耐药性提供了新思路，具有重要的临床转化价值。