《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Selective vanillate production from sugarcane bagasse-derived aromatic compounds using an engineered
Pseudomonas sp. NGC7-based strain
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香兰酸生物合成工程菌株开发及其选择性生产优化。通过敲除vanA4B4基因构建的工程菌株可在无糖类条件下利用制糖渣提取液中的芳香酸生长并选择性生产香兰酸。结合固体相萃取浓缩提取液和流化床培养技术，验证了vanR2调控基因突变和Paenibacillus praI酶协同作用对抑制副产物积累的关键作用，最终实现4.30 mM香兰酸产量及77 mol%的选择性转化率。
贾汉吉尔·阿拉姆博士（Md. Jahangir Alam）|小田直也（Naoya Kodama）|池田和马（Kazuma Ikeda）|村木香奈（Kanami Muraki）|樋口雄大（Yudai Higuchi）|藤田正也（Masaya Fujita）|上村直文（Naofumi Kamimura）|正井英二（Eiji Masai）|栗原宏之（Hiroyuki Kurihara）|宗木智纪（Tomonori Sonoki）
日本岩手县盛冈市岩手大学联合农业科学研究生院，邮编020-8550
在这项研究中，将假单胞菌属NGC7菌株进行基因工程改造，使其能够从甘蔗渣碱性提取物中的芳香化合物中选择性地产生香兰酸（VA）。从NGC7菌株中分离出vanA4B4基因（负责香兰酸O-去甲基化反应的酶）缺失的突变株，该突变株能够在不含糖分的提取物中生长并产生香兰酸。提取物中的有机酸促进了菌株的生长。通过使用DIAION HP20树脂进行固相萃取，进一步浓缩了提取物中的芳香物质，并将有机酸分离为不同的组分。使用这种浓缩的碱性提取物对NGC7ΔvanA4B4菌株进行分批培养后，香兰酸的产量有所增加；然而，尽管该菌株拥有降解香兰酸和4-羟基苯甲酸（HBA）的基因，但在生产香兰酸的同时也观察到了这两种物质的积累。对能够降解香兰酸同时产生香兰酸的突变株进行分析后发现，vanR2基因的突变使得在香兰酸生产过程中也能实现香兰酸的降解。vanR2基因是负责调控香兰酸降解相关基因转录的抑制因子。此外，来自Paenibacillus属JJ-1b菌株的praI基因（一种HBA羟化酶）的表达有助于高效降解HBA。因此，vanR2基因的突变和praI基因的表达是实现选择性香兰酸生产的关键工程策略。由于提取物中的有机酸促进了工程菌株的生长，因此还在添加了矿物盐和金属的流动培养基中评估了从浓缩提取物中生产香兰酸的效果。最终，在实际培养基中，这种工程改造的香兰酸生产菌株产生了4.30 mM的香兰酸，产率为77 mol%。
研究方法概述
评估工程菌株香兰酸生产能力的一般程序
本研究中使用的所有NGC7衍生菌株详见表S2。每种NGC7衍生菌株被接种到10 mL的Lysogeny肉汤（LB）中，在30 °C下摇床培养16小时。细胞通过离心（12,000 × g，5分钟，4 °C）收集，用生理盐水洗涤两次后重新悬浮，使其在600 nm处的光密度（OD600）达到5。将此悬浮液作为接种液（0.2 mL）加入到10 mL的MMx-3培养基中（成分包括Na2HPO4·12H2O 34.2 g/L和KH2PO4 6.0 g/L）中。
从BAE中生产香兰酸的初步评估
如上所述，BAE含有香兰酸（VA）、芳樟酸（FA）、4-羟基苯甲酸（HBA）、HBN等成分以及有机酸，而NGC7菌株可以利用这些芳香物质作为唯一的碳源进行生物量和能量的生产（24）。研究表明，NGC7菌株拥有四个编码香兰酸O-去甲基化酶（vanA1-vanA4）及其相应氧化还原酶（vanB1-vanB4）的基因组。其中，vanA4B4基因被确定为NGC7菌株中负责香兰酸降解的基因组（8）。因此，推测...
CRediT作者贡献声明
贾汉吉尔·阿拉姆博士（Md. Jahangir Alam）：撰写初稿、数据可视化、结果验证、方法设计、实验研究。小田直也（Naoya Kodama）：方法设计、实验研究。池田和马（Kazuma Ikeda）：实验研究。村木香奈（Kanami Muraki）：实验研究。樋口雄大（Yudai Higuchi）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、结果验证、方法设计。藤田正也（Masaya Fujita）：撰写、审稿与编辑。上村直文（Naofumi Kamimura）：撰写、审稿与编辑。正井英二（Eiji Masai）：撰写、审稿与编辑。栗原宏之（Hiroyuki Kurihara）：撰写、审稿与编辑、方法设计、概念构建。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
作者声明未使用生成式AI来撰写本手稿。手稿中的语法错误通过AI辅助技术进行了修正。手稿还经过了专业的英语编辑服务校对。
致谢
本研究部分得到了JST COI-NEXT（JPMJPF2104）项目、弘前大学未来创新研究基金以及孟加拉国邮政、电信和信息技术部信息与通信技术部门的支持。同时感谢弘前大学的基因研究中心和共享科学技术设施中心提供的技术支持。Y.H.、N.K.、E.M.和T.S.是相关专利的发明人。
