PEG链的长度通过配体暴露和最佳糖簇构象来调节GalNAc脂质体的肝脏靶向性

《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：PEG chain length modulates hepatic targeting of GalNAc liposomes via ligand exposure and optimal glycocluster conformation

本研究通过酶催化合成不同链长的胆固醇-GalNAc（CHS-PEGn-6-GalNAc，n=2-5）修饰脂质体，优化PEG链长以平衡糖暴露与糖簇构象，显著提升体外肝细胞摄取（P<0.01）和体内肝靶向效率（P<0.01），证实PEG3链长通过协同增强糖基可及性与糖簇稳定性实现最佳肝靶向效果。

　　本研究探讨了胆固醇-半乳糖醛酸（GalNAc）连接体中聚乙二醇（PEG）链长对脂质体肝靶向能力的影响。通过平衡糖基暴露与糖簇构象，研究人员优化了PEG链长度，以提高脂质体在肝脏中的靶向效率。所合成的连接体为CHS-PEG?-6-GalNAc（n=2-5），并将其整合到脂质体中，形成LP-PEG?-6-GalNAc。研究通过体外HepG2细胞摄取实验、体内小鼠生物分布分析以及分子动力学（MD）模拟来评估系统的性能。结果显示，LP-PEG?-6-GalNAc在体外实验中表现出显著更高的摄取率（P<0.01，与未修饰脂质体相比），并在体内实验中显示出更优的肝脏积累能力（P<0.01）。ASGPR介导的靶向性得到了竞争性抑制实验的验证（GalNAc体外、脱唾液酸糖蛋白体外；两者P<0.01）。靶向效率呈现出与PEG链长相关的趋势：PEG?>PEG?>PEG?>PEG?。MD模拟揭示了PEG链长对糖簇稳定性与糖基可及性的影响机制。较短的PEG链（如PEG?）能够维持较高的糖簇稳定性（频率=40.8%；RMSF=0.39 ?），但限制了GalNAc的可及性（SASA=49.9%）。相比之下，较长的PEG链（如PEG?-5）增加了SASA（73.38-86.08%），但降低了糖簇的稳定性（频率=23.0-35.0%；RMSF=1.05-1.30 ?）。PEG?则在SASA（61.7%）和稳定性（36.2%）之间实现了最佳平衡，从而协同增强了脂质体的摄取能力。这一发现首次提供了证据，表明PEG链长在协调糖基可及性与糖簇稳定性方面具有关键作用，从而提高肝脏靶向性。

肝脏作为人体代谢异物的重要器官，持续暴露于药物、病原体和有毒代谢产物，这导致了肝损伤、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的高发病率。HCC是全球第五大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因。流行病学研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是HCC的主要风险因素。全球约有20亿人感染HBV，每年导致约32万人死亡；而截至2020年，全球约有5700万人患有慢性HCV感染。鉴于肝细胞功能障碍在这些肝病中的核心作用，开发高效的肝细胞靶向递送系统具有重要的临床意义。

脂质体作为一种经典的药物载体，能够通过包裹水溶性和脂溶性药物来提高药物的稳定性和延长其在血液中的半衰期。然而，它们的非特异性分布限制了肝细胞靶向的效率。近年来，主动靶向策略的进展显著提升了药物递送的精准度，例如在脂质体表面修饰具有配体-受体结合特性的分子（如抗体、肽和糖基化连接体）。作为肝细胞特异性C型凝集素，ASGPR能够识别带有末端β-D-半乳糖（Gal）或N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的糖基化连接体，这使其成为肝脏靶向的理想分子靶点。值得注意的是，GalNAc与ASGPR的结合亲和力比Gal高10-50倍，这为选择GalNAc作为肝脏靶向配体提供了充分的理论依据。

尽管GalNAc与ASGPR具有强亲和力，但体内靶向的脂质体仍受到网状内皮系统（RES）的快速清除所限制。研究表明，血浆蛋白在脂质体表面形成的“蛋白冠”会增强巨噬细胞的摄取，从而加速脂质体的清除。虽然聚乙二醇（PEG）接枝可以通过空间稳定化和水合层形成（即“隐形效应”）来减少蛋白吸附，但过长的PEG链会引入空间位阻，遮蔽靶向配体，进而降低ASGPR介导的靶向效率。因此，如何在隐形特性与靶向效率之间取得平衡，是当前药物递送研究中的关键科学挑战。为了解决这一问题，研究团队提出了一种新颖的配体设计策略：合成兼具GalNAc靶向功能和短PEG链的双功能分子。这种方法利用PEG的抗补体作用来减轻RES的清除，同时优化PEG链长以最小化对配体-受体识别的干扰。

在之前的研究中，研究者比较了胆固醇-半乳糖连接体中使用亲水性（PEG?）和疏水性（8个CH?单元）连接子的差异。结果发现，使用PEG?连接的配体（CHS-PEG?-6-GalNAc）在ASGPR结合方面表现出更强的亲和力，相较于其疏水性对照（CHS-6-GalNAc）。MD模拟进一步证实，亲水性连接子能够显著提高配体头部基团的相对溶剂可及表面积（SASA），从而减少ASGPR结合过程中的空间位阻。然而，如何通过调整亲水性PEG链长来调控ASGPR结合亲和力，仍是一个未被充分探索的问题，尤其是在控制糖簇几何结构方面具有关键作用。

为了解决这一知识空白，研究团队开发了一种顺序酶促合成策略。首先，通过脂肪酶催化酯化反应合成胆固醇锚定的PEG?（CHS-PEG?；n=2,3,4,5），随后利用脂肪酶催化的选择性酯化反应，将GalNAc特异性连接到PEG末端，形成CHS-PEG?-6-GalNAc。这种酶促方法不仅实现了对PEG链长的精确控制，还优化了配体对ASGPR结合位点的可及性，从而允许系统性研究PEG链长对脂质体肝细胞靶向能力的影响。通过体外和体内实验，研究者旨在评估所合成脂质体的肝细胞靶向效率，同时利用MD模拟来揭示PEG链长与ASGPR亲和力之间的结构-活性关系。本研究的总体目标是验证PEG链长优化是否能够协同增强隐形效应与靶向效率，从而为肝脏靶向递送系统的理性设计提供新的见解。

在实验材料方面，研究人员使用了多种化学试剂和酶促催化剂。例如，醋酸钯、1,10-菲啰啉、3,3′-二辛基氧杂羰氰基 perchlorate（DiO）和1,1′-二辛基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚三羰氰基碘化物（DiR）均从Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd.（中国上海）购得。Candida antarctica脂肪酶B（Novozym 435，10,000 U/g?1）和Thermomyces lanuginosus脂肪酶（Lipozyme TL IM，330 U/g?1）则来自Novozymes Biotechnology Co., Ltd.（中国北京）。氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）和胆固醇（CHS）也作为关键原料被用于脂质体的制备。这些材料的选择和使用为后续的合成和实验提供了坚实的基础。

合成路线方面，研究团队首先通过酯化反应合成PEG?-二乙烯酯。具体而言，在一个1000 mL三颈圆底烧瓶中，将COOH-PEG?-COOH（0.1 mol）、乙烯基乙酸酯（2 mol）、醋酸钯（0.005 mol）和1,10-菲啰啉（0.0075 mol）混合，并在60°C的恒温水浴中搅拌48小时。反应完成后，有机相用10%（w/v）碳酸氢钠溶液洗涤，干燥后通过旋转蒸发在减压条件下浓缩。这一步骤为后续的酶促合成奠定了基础，确保了PEG链长的精确控制。接下来，通过酶促反应将GalNAc连接到PEG链末端，形成最终的CHS-PEG?-6-GalNAc。这一过程利用了脂肪酶的催化能力，实现了对GalNAc连接位点的特异性修饰，从而确保了连接体的结构稳定性与功能完整性。

胆固醇（CHS）作为脂质体构建的重要组成部分，因其良好的生物相容性、成本效益和易于功能化而被广泛应用于脂质纳米载体的工程设计中。更重要的是，其疏水性和刚性结构使其能够深入磷脂双分子层，与PEG的空间位阻效应相结合，形成稳定的膜整合结构，这种结构只有在被主动内化时才会发生解离。相比其他磷脂衍生物（如DSPE），CHS的这种特性使其在长期稳定性和靶向效率方面表现出显著优势。通过精确控制PEG链长，研究人员能够在维持脂质体稳定性的同时，优化其与ASGPR的结合能力，从而提高肝脏靶向效率。

本研究的结论表明，通过调控PEG链长，可以有效协调脂质体的隐形效应与靶向效率。研究发现，PEG链长对脂质体的肝细胞靶向能力具有双重调节作用。一方面，较短的PEG链（如PEG?）能够保持最优的多价糖簇几何结构，但由于其刚性较高，限制了GalNAc的可及性。另一方面，较长的PEG链（如PEG?-5）虽然能够最大化溶剂暴露面积，但会降低糖簇的稳定性。相比之下，PEG?在糖基可及性（SASA=61.7%）和糖簇稳定性（RMSF=36.2%）之间达到了最佳平衡，从而协同增强了脂质体的摄取能力。这一结果首次揭示了PEG链长在调节糖基可及性与糖簇稳定性方面的关键作用，为设计更高效的肝脏靶向递送系统提供了重要的理论支持和实验依据。

通过体外实验，研究人员评估了不同PEG链长的脂质体对HepG2细胞的摄取能力。结果显示，LP-PEG?-6-GalNAc在体外实验中表现出显著更高的摄取率，特别是在PEG?的情况下，其摄取能力远超其他PEG链长的脂质体。这一结果表明，PEG链长的优化对于提高脂质体的肝细胞靶向性至关重要。在体内实验中，研究人员利用小鼠模型评估了脂质体的生物分布情况。结果表明，PEG?修饰的脂质体在肝脏中的积累显著优于其他PEG链长的脂质体，进一步验证了其在体内环境中的靶向优势。

此外，研究还通过竞争性抑制实验确认了ASGPR介导的靶向机制。在体外实验中，GalNAc的加入能够有效抑制LP-PEG?-6-GalNAc对HepG2细胞的摄取，表明其靶向性依赖于ASGPR的结合。在体内实验中，脱唾液酸糖蛋白（asialofetuin）的使用同样显示出对肝脏靶向能力的显著抑制作用，进一步支持了ASGPR作为肝脏靶向的关键受体这一观点。这些实验结果不仅揭示了PEG链长对靶向效率的影响，还为理解脂质体与肝脏细胞之间的相互作用提供了新的视角。

MD模拟的结果进一步揭示了PEG链长对糖簇稳定性与糖基可及性的影响机制。模拟结果显示，PEG?链能够维持较高的糖簇稳定性，但由于其刚性较高，限制了GalNAc的可及性。相比之下，PEG?-5链虽然能够显著增加GalNAc的可及性，但会导致糖簇结构的不稳定性。PEG?则在两者之间实现了平衡，既保持了较高的糖簇稳定性，又增强了GalNAc的可及性，从而显著提高了脂质体的靶向效率。这一发现为理解PEG链长在调节脂质体与肝脏细胞相互作用中的作用提供了重要的分子机制支持。

通过这一系统性的研究，研究人员不仅验证了PEG链长对肝细胞靶向能力的影响，还揭示了其背后的分子机制。这些结果对于开发更高效的肝脏靶向药物递送系统具有重要的指导意义。未来的研究可以进一步探索不同PEG链长对脂质体在不同肝脏疾病模型中的靶向效率，以及如何通过优化PEG链长来提高药物的治疗效果。此外，还可以结合其他靶向配体，进一步增强脂质体的靶向特异性，从而为肝脏疾病的治疗提供更加精准和高效的药物递送方案。