甘草酸修饰的葛根蛋白负载着针对木犀草素的纳米颗粒，用于缓解对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤

《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Glycyrrhizic acid-modified pueraria protein loaded with luteolin-targeted nanoparticles for alleviation of acetaminophen-induced acute liver injury

葛根蛋白经甘草酸修饰后作为载体包载黄芩素形成靶向肝细胞纳米颗粒，显著提升溶度并增强抗氧化活性，有效缓解对乙酰氨基酚诱导肝损伤，效果优于常规治疗剂。

　　

郭佳鑫|刘云|刘新阳|秦华聪|张雪|余波

长春中医药大学医学院，中国长春，130117

摘要

葛根（Pueraria lobata）广泛用于功能性食品和传统中药中。葛根蛋白（PP）作为副产品被大量生产，但尚未得到充分利用。在本研究中，研究人员提取了葛根蛋白，并用甘草酸（GL）对其进行修饰，使其成为木犀草素（Lut）的载体材料，从而制备出了具有肝细胞亲和性的纳米颗粒（GL-PP-Lut NPs）。对这些纳米颗粒进行了表征，并研究了其在模拟胃肠道液体中的释放行为。结果表明，GL-PP-Lut NPs呈负电荷，呈准球形结构，粒径约为104.02纳米，包封效率为93.17%，药物载量为23.29%。此外，其溶解度比木犀草素高约84倍，木犀草素主要以无定形状态被包裹在GL-PP中。在阿司匹林（APAP）诱导的肝损伤细胞中，GL-PP-Lut NPs在LO-2细胞中的积累量比其他细胞高5-10倍，显示出对肝细胞的优异亲和性。体内实验表明，GL-PP-Lut NPs能有效逆转APAP过量引起的ALT、AST、ALP和胆红素水平异常升高，恢复GSH、SOD和CAT的水平，并抑制促炎因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的释放，从而减轻急性肝损伤（ALI）的程度。这些结果表明，葛根蛋白可能是一种有前景的新型药物递送材料。

引言

葛根自古以来就被用作药用草本植物和功能性食品。它常与其他草药结合，制成汤剂用于治疗肝损伤[1]、关节炎[2]、动脉粥样硬化[3]、高血压[4]、糖尿病[5]和心力衰竭[6]等疾病。研究表明，在葛根提取过程中，会自发形成微米或纳米级的胶体颗粒，这些颗粒携带生物活性成分，比传统汤剂具有更强的疗效[8]。葛根中的主要活性成分葛根素（Puerarin）尤其在酒精性肝损伤[9]、心血管疾病[10]和帕金森病[11]的治疗中表现出显著效果。从葛根中提取的葛根蛋白（PP）也具有显著的治疗作用，但尚未得到充分利用。先前的研究表明，PP具有显著的抗氧化特性，能够协同增强生物活性物质的疗效，从而增强抗氧化和抗炎作用。迄今为止，尚未有研究探索PP作为新型药物递送材料的潜力。因此，本研究为葛根蛋白的应用提供了新的可能性。

木犀草素（Lut）是一种四羟基黄酮类化合物，广泛存在于芹菜[12]、青椒、紫苏叶和花生壳[13]等食物中。研究表明，木犀草素不仅可以通过缓解细胞氧化应激[14]、抑制炎症因子表达[15]、抑制细胞凋亡和线粒体应激[16]来保护受损的肝细胞，还可以通过恢复谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等物质的活性来发挥作用[17]。然而，由于其溶解度和生物利用度较低，其在临床肝损伤治疗中的应用受到限制[18]。近年来，研究人员通过将其包裹在各种递送系统（如固体分散体、水凝胶、纳米颗粒和乳液等）中提高了木犀草素的生物利用度[19][20][21][22][23]。然而，未经改性的递送系统往往在到达靶点之前就被清除，导致到达作用部位的药物量有限[24]。增加剂量又会增加不良反应的风险。因此，对葛根蛋白的结构进行化学修饰以增强其在肝组织中的递送和积累效果至关重要[25]。

甘草酸（GL）是甘草的主要活性成分，具有多种药理作用，包括抗炎[26,27]、抗肿瘤[28]和保肝[29]作用。值得注意的是，许多研究发现肝细胞表面存在能特异性识别甘草酸的受体[31]。使用GL修饰的递送系统表现出显著的肝靶向效果，解决了传统药物递送系统中药物滞留不足和有效浓度偏低的问题[32]。因此，本研究采用GL修饰葛根蛋白（GL-PP），以实现向肝细胞的靶向递送。然而，现有的GL修饰载体仍存在局限性：传统的修饰方法主要依赖合成聚合物材料（如PLGA）[33]；修饰后仅实现靶向递送，载体本身缺乏药理活性，无法充分发挥甘草酸的协同治疗作用[34]；此外，纳米载体的制备需要多个包封或化学偶联步骤，显著增加了生产复杂性。本研究使用的GL-PP具有天然的双重功能协同效应：葛根蛋白本身具有抗氧化和保肝作用，与甘草酸的保肝效果结合后，形成了一个集成的“递送-治疗”系统，克服了传统载体仅作为“惰性运输工具”的局限性；此外，植物蛋白载体无毒且免疫原性低，代谢产物为氨基酸，确保了良好的生物安全性。

本研究制备了负载木犀草素的甘草酸-葛根蛋白纳米颗粒（GL-PP-Lut NPs），并通过表征、抗氧化实验、稳定性测试和模拟胃肠道消化实验研究了其理化性质。此外，还通过体内和体外实验研究了GL-PP-Lut NPs缓解阿司匹林（APAP）诱导的肝损伤的能力。结果表明，GL-PP-Lut NPs对肝细胞具有更强的亲和性，能有效保护小鼠免受APAP诱导的肝损伤（ALI），其疗效略优于临床治疗药物N-乙酰半胱氨酸（NAC）。这项研究为天然蛋白质作为药物载体的应用提供了新的可能性。

材料

新鲜的葛根（Beijing Tongrentang）；甘草酸（93%）、木犀草素（98%）、过氧化氢钠（NaIO₄）、甘草酸酯和阿司匹林购自上海源业生物技术有限公司（中国上海）；羟基自由基清除能力检测试剂盒和总抗氧化能力检测试剂盒购自上海麦克林生化有限公司（中国上海）；LO-2、RAW264.7和HEK-293细胞购自中国科学院细胞库

GL-PP偶联程度和FT-IR分析

肝细胞表面存在大量甘草酸受体（GA-R），它们能特异性结合甘草酸。利用甘草酸作为靶向单元，可以将药物定向递送到肝细胞，从而提高药物的肝靶向性，减少剂量和副作用[44]。甘草酸分子含有一个相邻的二葡萄糖醛酸结构，可被NaIO₄氧化生成醛基。

结论

葛根蛋白是葛根素提取过程中的主要副产品，目前尚未得到有效利用。本研究采用甘草酸修饰的葛根蛋白作为载体来包裹木犀草素，制备出了GL-PP-Lut NPs。与木犀草素相比，GL-PP-Lut NPs的溶解度提高了约84倍，表现出更强的稳定性、抗氧化活性以及缓解APAP诱导的肝损伤的能力。

作者贡献声明

郭佳鑫：撰写初稿、验证方法、数据分析、概念构思。刘云：软件开发、实验设计。刘新阳：软件开发。秦华聪：数据可视化、结果验证、实验设计。张雪：数据可视化。余波：撰写修订稿、项目监督、资源协调、资金申请。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。