重组内溶酶LysNOVA-I对生长中的/非生长中的金黄色葡萄球菌菌株以及浮游菌/生物膜菌落的抗菌活性

《Journal of Global Antimicrobial Resistance》：Antibacterial activity of recombinant endolysin LysNOVA-I against growing/non-growing and planktonic/biofilm cultures of Staphylococcus aureus strains

噬菌体来源的内溶酶LysNOVA-I高效裂解金黄色葡萄球菌及其生物膜，尤其对临床相关MRSA ST398菌株具有显著杀菌活性，并通过结构解析揭示了其多模块作用机制。

　　近年来，抗生素耐药性问题已成为全球公共卫生领域最紧迫的挑战之一。据预测，到2050年，因抗生素耐药性导致的死亡人数可能达到1000万。这一趋势不仅威胁着人类健康，还对动物健康构成重大影响，进而对全球公共卫生体系和经济发展产生深远的冲击。世界银行的报告指出，如果抗生素耐药性问题得不到有效控制，可能会导致全球GDP每年减少3.8%，并可能使2800万人陷入贫困。因此，寻找新型抗菌策略已成为科学研究的重要方向。

在这一背景下，噬菌体编码的溶菌酶（endolysins）作为一种新兴的抗菌手段，正受到越来越多的关注。这些酶是噬菌体在裂解宿主细菌的过程中释放的，能够特异性地降解细菌细胞壁。由于其高特异性、对微生物群落影响小、不易产生耐药性以及对哺乳动物细胞无害等特性，溶菌酶被认为是抗生素的理想替代品。此外，它们还具有可降解性，从而降低了对环境的潜在影响。

本研究旨在识别一种针对金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）的溶菌酶，并通过基因工程手段构建其重组形式，进一步评估其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌效果。金黄色葡萄球菌是一种广泛存在于人类和动物体内的病原体，与多种严重感染密切相关，包括皮肤和软组织感染、骨髓炎、社区和医院获得性肺炎、败血症以及心内膜炎等。在动物医学中，它也是奶牛乳腺炎的重要致病菌。由于其对多种抗生素表现出耐药性，MRSA感染的治疗难度极大，且具有较高的死亡率。因此，开发针对MRSA的新抗菌策略显得尤为迫切。

研究人员通过分析阿根廷本土的噬菌体基因组，发现了一种高度保守的序列，该序列编码了一种可能对金黄色葡萄球菌具有特异性作用的溶菌酶。基于这一发现，研究团队构建了重组溶菌酶（LysNOVA-I），并对其进行了表达、纯化及功能验证。该重组溶菌酶不仅在培养过程中表现出良好的溶菌活性，还能有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，并破坏已建立的生物膜结构。这一特性使其在对抗慢性感染和耐药菌株方面具有重要潜力。

在实验过程中，研究团队采用了多种方法对LysNOVA-I进行了深入分析。首先，通过生物信息学工具（如Blastp和ClustalW）对溶菌酶的氨基酸序列进行了比对，揭示了其结构和功能域的分布情况。结果显示，LysNOVA-I包含三个主要的功能域：N端的CHAP结构域、中央的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸氨肽酶结构域以及C端的SH3b结构域。这些结构域在细菌细胞壁降解、模式识别以及多蛋白复合物的组装过程中发挥关键作用。CHAP结构域中的催化三联体（Cys32、His95和Glu111）以及氨肽酶结构域中的锌离子结合三联体（His206、His313和Cys321）均显示出高度的保守性，这表明LysNOVA-I在进化过程中具有较高的稳定性，可能对多种金黄色葡萄球菌菌株具有广泛的抗菌作用。

为了进一步验证LysNOVA-I的功能，研究团队在实验室条件下对其进行了表达和纯化。通过使用带有His标签的MBP（麦芽糖结合蛋白）融合系统，成功表达了LysNOVA-I，并利用亲和层析技术（包括Amylose树脂和镍柱）进行了纯化。实验结果显示，Amylose树脂在纯化过程中表现出更高的效率，能够获得接近10倍于镍柱纯化的蛋白量。此外，基于AlphaFold3的结构预测表明，MBP融合并未干扰溶菌酶的天然折叠结构，这使得LysNOVA-I在纯化后仍保持良好的活性和稳定性。

在溶菌活性测试中，研究团队将LysNOVA-I与常用的β-内酰胺类抗生素（如氯唑西林）进行了比较。结果显示，LysNOVA-I在非生长状态的细菌细胞和生物膜中均表现出显著的溶菌效果。相比之下，氯唑西林在非生长状态的细菌细胞中几乎没有抗菌作用，而LysNOVA-I则能够有效降低细菌数量。在生长状态的细菌中，两种处理方式均表现出一定的抗菌效果，但LysNOVA-I的溶菌活性明显高于氯唑西林。这些结果表明，LysNOVA-I在对抗金黄色葡萄球菌的感染方面具有明显的优势，尤其是在抗生素无法有效作用的非生长状态下。

进一步的研究还评估了LysNOVA-I对临床相关MRSA菌株的抗菌效果。实验选用了一种具有广泛传播能力和全球分布特征的MRSA菌株ST398，该菌株对多种抗生素表现出耐药性，包括氯霉素、头孢菌素、红霉素等。结果显示，LysNOVA-I在不同浓度下均能有效降低ST398菌株的细菌负荷，且其溶菌效果优于传统抗生素。这一发现为LysNOVA-I在临床和兽医领域的应用提供了有力的支持。

值得注意的是，LysNOVA-I的溶菌活性不仅局限于生长状态的细菌，还能够有效破坏已经形成的生物膜。生物膜是细菌在宿主环境中形成的一种保护结构，能够显著降低抗生素的渗透性和杀菌效率。因此，LysNOVA-I在破坏生物膜方面的表现尤为重要。实验中，研究团队通过模拟生物膜的形成和降解过程，评估了LysNOVA-I的抗菌效果。结果显示，该溶菌酶在抑制生物膜形成和破坏已形成的生物膜方面均表现出优异的性能，尤其是在高浓度下效果更为显著。

从实际应用的角度来看，LysNOVA-I的重组表达和纯化技术为其大规模生产和临床应用奠定了基础。利用大肠杆菌作为表达宿主，结合MBP融合系统，使得该蛋白的生产过程更加高效且成本可控。此外，LysNOVA-I的溶菌活性不受细菌代谢状态的影响，能够在多种条件下有效作用，这使其在治疗慢性感染和耐药菌株方面具有广阔的应用前景。

尽管LysNOVA-I表现出良好的抗菌效果，但其在实际应用中仍面临一些挑战。例如，溶菌酶的免疫原性可能会影响其在体内的应用效果，尤其是在重复给药的情况下，可能会引发宿主免疫反应，从而降低其疗效或产生不良反应。因此，未来的研究需要进一步优化其结构，例如通过PEG化、结构域重排或局部给药等策略，以减少免疫反应并提高其在体内的稳定性。

此外，虽然LysNOVA-I在金黄色葡萄球菌中表现出较广的抗菌范围，但其对其他细菌的活性仍需进一步研究。目前的实验主要集中在金黄色葡萄球菌及其耐药菌株上，未来的研究可以扩展到其他病原菌，以评估其更广泛的抗菌潜力。这不仅有助于提高其在临床和兽医领域的应用价值，也为开发新一代抗菌药物提供了新的思路。

综上所述，LysNOVA-I作为一种新型的抗菌策略，展现了在对抗抗生素耐药菌株方面的巨大潜力。其高度保守的结构域、良好的溶菌活性以及对生物膜的有效破坏，使其成为治疗金黄色葡萄球菌感染的理想候选药物。然而，为了实现其在实际医疗和兽医领域的广泛应用，还需要进一步研究其免疫原性、递送方式以及与其他抗菌药物的协同作用。未来的研究应聚焦于这些方面，以推动LysNOVA-I从实验室走向临床应用，为全球抗生素耐药性问题提供新的解决方案。